目的:肌萎缩侧索硬化( Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一种逐渐进展的致命性的神经系统退行性疾病。其病理特征表现为脊髓、运动皮层及脑干运动神经元丢失。临床表现为肌肉的萎缩无力、瘫痪,逐渐丧失劳动能力,呼吸肌麻痹,患者通常在发病3-5年内死亡。目前ALS确切的病理机制仍然不清,该病90%～95%的患者没有明显的遗传因素,即散发性ALS(sALS),其余5%～10%的患者属于显性遗传病,也称为家族型ALS ( fALS),后者中大约1/5患者中有铜/锌过氧化物歧化酶( SOD1)的突变,表达人突变SOD1基因的转基因小鼠临床及病理表现与人ALS相似。多个研究证实家族性ALS中存在SOD1基因突变,突变位点几乎跨越整个SOD1分子。多数为错义突变,引起表达蛋白中某个氨基酸的替换;少数为非错义突变---早期终止突变,导致翻译后蛋白分子的一段序列缺失。错义突变中以外显子中密码子第4位丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val),即A4V突变,为最常见的突变位点。最初认为,mSOD1引起ALS的可能机制是mSOD1酶活性降低,导致自由基清除障碍,从而继发氧化损伤运动神经元(motor neuron,MN),但是后续研究却发现部分mSOD1保持一定甚至全部的酶活性。过表达野生型SOD1(wtSOD1)并不会减轻转基因小鼠ALS的症状,甚至使症状恶化,同时敲除SOD1基因的小鼠并没有出现明显的ALS病状,推测ALS的发生可能与mSOD1获得性毒性作用有关。目前已建立了多种表达人SOD1(hSOD1)突变的转基因鼠模型,其中hSOD1G93A转基因小鼠应用最广泛,是目前国际上公认的ALS发病机制及临床前药物研究的动物模型。最近ALS病理机制之一内质网应激(ERS)逐渐受到关注,且已发现ALS的脊髓前角、大脑皮层及脑干运动神经元选择性丢失大多数是由凋亡引起的。凋亡(apoptosis)又叫程序性细胞死亡,是指机体在生理条件下受到刺激后,经过多种信号传递导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起细胞自杀的过程。自1972年John Korr第一次提出凋亡概念后,经三十几年的研究目前已知有三条主要的信号转导通路来调控细胞凋亡:(1)线粒体通路;(2)死亡受体通路;(3)内质网通路。当内质网内未折叠蛋白负荷严重超过内质网折叠能力时,就将导致内质网腔内的未折叠蛋白聚集,从而导致内质网应激,其表现为未折叠蛋白反应(unfolded porotein response UPR)、内质网相关降解(ERAD)和细胞凋亡。UPR是由一个内质网分子伴侣GRP78/BIP和三个内质网应激感受蛋白所介导的,三个感受蛋白分别是PERK(PKR-like ER kinase),ATF6 (activating transcription factor 6)和IRE-1(inositol-requiring enzyme 1),当发生内质网应激时引起GRP78/BIP与三个感受蛋白PREK、AFT6和IRE-1的分离,进而激活PREK、ATF6和IRE-1三条信号通路。ATF6(转录激活因子)为Ⅱ型跨膜蛋白,胞浆部分含有bZip转录因子结构域和转录激活区域,其在非内质网应激状态下,其内质网腔部分结合伴侣蛋白BIP,并以这种无活性状态( P90ATF6)存在。活化后与BIP分离,并在高尔基体内被S1P、S2P蛋白酶水解,形成p50ATF6的活化形式,转运至细胞核内,活化后的ATF6可增加一系列目的基因的表达,包括BIP、CHOP/GADD153、钙网织蛋白和ERAD蛋白表达增加,同时也增加XBP1的转录,并激活ERSE,最终引起运动神经元凋亡。最近研究表明在家族性肌萎缩侧索硬化动物模型hSOD1G93A小鼠的脊髓中存在内质网应激和内质网应激引起的细胞凋亡。本文将初步研究hSOD1G93A小鼠的脊髓中是否存在内质网应激中ATF6信号通路的激活,进而探究内质网应激在ALS发病机制中的作用。方法:第一部分:hSOD1G93A转基因小鼠及其同窝对照组小鼠的获得:以B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J半合子雄鼠及B6SJLF1/J +/+雌鼠配种,提取小鼠尾尖DNA,进行hSOD1G93A基因的PCR分析鉴定,鉴定出含hSOD1G93A转基因的小鼠和不含hSOD1G93A基因的小鼠;将上述鉴定阳性的小鼠做为本实验的实验组,鉴定阴性的小鼠做为对照组。第二部分:(1)实验分组无症状组hSOD1G93A转基因小鼠3只(60天)、症状早期hSOD1G93A转基因小鼠3只(约105-115天),终末期hSOD1G93A转基因小鼠3只(约120-130天),对照组为鉴定阴性的小鼠3只(120天)。(2)于各时间点用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,快速暴露心脏,经4%多聚甲醛灌注固定心脏后,取出腰段脊髓,浸泡在4%多聚甲醛48小时后,震动切片机连续切片,每片厚20μm,冰冻切片机连续切片,每片厚30μm。(3)免疫荧光化学染色冰冻切片经0.01M PBS连续漂洗三次,各5分钟,10% H2 O2室温中15分钟,0.01M PBS;连续洗三次,各5分钟,经0.3%TritonX-100打孔切片后,10%马血清封闭1小时,加入1∶200 ATF6(SANTA CRUZ)兔多克隆抗体和1:1000 SMI32(美国Sigma公司)鼠多克隆抗体,4℃孵育摇床过夜;经0.01M PBS连续漂洗三次,各5分钟,避光加入1:200FITC和CY5荧光二抗,室温摇床1.5小时,经0.01M PBS连续漂洗三次,各5分钟,荧光衰减淬灭剂封片,激光共聚焦显微镜观察。(4)免疫组织化学染色震动切片经0.01M PBS连续漂洗三次,各5分钟,10% H2O2室温中15分钟,0.01M PBS;连续洗三次,各5分钟,经0.3%TritonX-100打孔切片后,10%马血清封闭1小时,加入1:200 ATF6(SANTA CRUZ)兔多克隆抗体,4℃孵育摇床过夜;经0.01M PBS连续漂洗三次,各5分钟,加入1:200生物素化山羊抗兔IgG,室温摇床2 h;0.01M PBS连续漂洗三次,各5分钟,加入1:200辣根酶标记链霉卵白素室温摇床1 h;DAB显色15分钟,蒸馏水终止显色,铺片、常规脱水、明胶封片。统计分析:实验结果以均值+标准差(x±s)表示,采用SPSS 17.0软件进行统计分析,四组比较采用非参数检验分析,两两比较采用t检验,统计结果以P<0.05为有显著性差异。结果:1经PCR将实验动物分为hSOD1G93A转基因小鼠和阴性小鼠。2症状早期和终末期较对照组和无症状组ATF6进入细胞核的运动神经元数量明显增多,具有统计学意义;症状早期和终末期相比无明显改变;对照组的ATF6表达位于运动神经元细胞质中,两组相比较无统计学意义;而症状早期组可见ATF6进入细胞核;3症状早期和终末期的一些细胞形态发生改变,出现皱缩,终末期运动神经元的数量大大减少。结论:在无症状组(60天)时没有发现内质网应激因子ATF6的改变,在ALS疾病症状早期出现明显的ATF6的改变,并随着疾病的进展而加重,终末期运动神经元数量大幅减少。说明内质网应激参与了ALS的发病,但ALS明确的病理机制尚需进一步的研究。