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目的
三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate, TOCP)被广泛用于制造业、工业和农业。作为最早被确定的能诱导人类发生迟发性神经病(Organophosphorus-induced delayed neuropathy, OPIDN)的有机磷化合物，TOCP常被用来诱导母鸡和猫等易感动物建立OPIDN实验动物模型。到目前为止，OPIDN的发病机制尚未阐明。OPIDN的主要病理表现为中枢神经长传导束和外周神经轴突的退变，是一种类似于Wallerian变性的病理改变。同时，脊髓前角运动神经元的丢失也与OPIDN的发病密切相关，然而目前临床上以凋亡为基础的治疗手段几乎没有任何进展，提示OPIDN中可能存在其他的细胞死亡形式。因此，深入研究OPIDN中轴突变性和神经元丢失相关的分子事件，不仅能够阐明TOCP诱导迟发性神经病的机制，还能够为临床治疗上寻找新的药物靶点提供依据。
在前期的实验中，本课题组通过TOCP经口染毒母鸡制备了OPIDN动物模型，并使用小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2a，N2a)建立了体外培养细胞染毒模型。本研究拟利用上述整体动物模型和体外细胞模型，检测了Wallerian变性相关蛋白的表达改变和程序性坏死信号通路的激活情况，在此基础上研究TRPA1通道激活介导的Ca2+浓度升高和Wallerian变性以及程序性坏死之间的上下游关系，以期探讨OPIDN中是否既存在神经元轴突的Wallerian样变性，又存在程序性坏死信号通路的激活，而TRPA1通道的激活导致神经元内Ca2+浓度的升高可能作为轴突退变和神经元死亡的上游事件发挥作用。
方法
1.TOCP染毒母鸡OPIDN动物模型和PMSF干预动物模型的建立
OPIDN动物模型的建立。健康成年罗曼母鸡适应性喂养7天后，被随机分为5组，每组5只，实验组经口一次性给予750mg/kg的TOCP，对照组给予相同体积的玉米油，分别在TOCP染毒后1天、5天、10天和21天时处死动物。在此期间，每天观察动物的双下肢活动情况，按照八级步态评分标准对动物OPIDN的临床症状进行评分。每组取3只动物用于WesternBlotting检测，在冰上快速取出坐骨神经和脊髓组织在液氮中冷冻后保存于-80℃。其余2只动物麻醉后，用4％甲醛溶液进行心脏灌注，取脊髓组织固定，进行病理检测和免疫荧光染色。
PMSF干预动物模型的建立:30只健康成年罗曼母鸡在适应性喂养7天后，被随机分为6组，每组5只，对照组给予同体积的玉米油，实验组均提前皮下注射90mg/kg的苯甲基磺酰氟(PMSF)24h后一次性经口染毒750mg/kg的TOCP，在染毒后的0天、1天、5天、10天和21天分别处死动物，冰上取出坐骨神经和脊髓组织后在液氮中快速冷冻并保存于-80℃用作WesternBlotting检测。期间每天对动物的双下肢活动情况进行记录，按照八级步态评分标准对实验动物OPIDN的临床症状进行评分。
2.TOCP染毒N2a细胞体外模型的建立
N2a细胞使用含10％血清的DMEM培养基培养，以5×104个/ml接种于9mm培养皿中，细胞贴壁后将培养液更换为含10μM视黄酸和2％血清的DMEM培养基诱导分化，在48h分化成功后给予TOCP。TOCP的染毒剂量为20μM，干预药物BATPA-AM的剂量为0.5μM，HC030031的剂量为5μM，而Nec-1的剂量为10μM。染毒24h后记录N2a细胞的形态学改变，并收集细胞。
3.N2a细胞轴突损伤观察、细胞内Ca2+浓度检测和免疫荧光检测
(1)N2a细胞轴突的改变:TOCP染毒24h后在显微镜下观察，每个组中随机选取10个视野进行观察和拍照记录(400x)。
(2)细胞内Ca2+浓度的检测:TOCP染毒N2a细胞24h后，在培养皿中加入Fluo-4-AM工作液，在荧光显微镜下观察细胞内Ca2+的染色情况，并将贴壁细胞轻轻吹打制作成细胞悬液，使用酶标仪测定荧光强度并计算各组细胞内Ca2+的浓度。
(3)细胞免疫荧光试验:荧光显微镜下观察N2a细胞中p-RIPK1的表达水平和分布情况。
4.动物组织和细胞内的Wallerian变性相关蛋白和程序性坏死信号通路中的蛋白检测
使用蛋白免疫印迹(Western Blotting)试验检测TOCP染毒和药物干预后动物组织和细胞内的Wallerian变性相关蛋白和程序性坏死信号通路中的蛋白表达量的改变。Wallerian变性相关蛋白包括NMNAT2、SARM1和STMN2，程序性坏死信号通路中的蛋白包括RIPK1、p-RIPK1(S166)、MLKL和p-MLKL(S345)。
4.统计学分析:
采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)法比较样本均数(P＜0.05)。
结果
1.OPIDN动物模型中存在类Wallerian变性和程序性坏死信号通路的激活。
(1)TOCP染毒动物的神经行为学改变:TOCP染毒5天后，实验组动物行走时出现了轻微的不稳和摇晃，随后OPIDN的症状逐渐加重，到15天时动物的行动能力减弱，协调性变差，不愿直立行走，行走时剧烈摇晃甚至跌倒，到18天时所有的动物都完全瘫痪，不能站立，直到21天处死动物时此状态一直没有任何好转或者恢复。而PMSF干预TOCP染毒的实验动物在21天时仍然能够正常行走，没有出现明显的OPIDN症状。
(2)OPIDN动物模型中Wallerian变性机制激活:WesternBlotting检测发现坐骨神经和脊髓组织中SARM1的表达量都显著升高，且NMNAT2的表达量显著降低，而PMSF干预组的坐骨神经中SARM1和NMNAT2的表达水平各组之间的差异没有统计学意义。除此之外，免疫荧光结果显示:在TOCP染毒10天组和21天组的脊髓前角运动神经元中出现了SARM1的高表达和聚集，且与线粒体蛋白TIM23存在共定位。
(3)TOCP染毒动物出现脊髓前角运动神经元的丢失和程序性坏死信号通路的激活:脊髓组织的病理检查结果显示前角运动神经元的数量减少，而WesternBlotting结果显示在脊髓和坐骨神经组织中都能够检测到RIPK1、p-RIPK1和p-MLKL的表达水平显著升高。而PMSF干预组的坐骨神经中上述蛋白的表达量在对照组和染毒组之间无明显差异。
2.TRPA1通道介导的细胞内Ca2+水平升高参与了类Wallerian变性和程序性坏死信号通路的激活。
(1)TOCP染毒和干预药物干预后N2a细胞内Ca2+浓度的检测:Ca2+荧光探针检测结果显示20μMTOCP染毒24h后N2a细胞内的Ca2+水平显著升高，而干预药物BATPA-AM和HC030031使用后均能显著抑制TOCP染毒导致的N2a细胞内Ca2+浓度增加，与TOCP染毒组相比差异具有统计学意义。但Nec-1和TOCP同时处理后N2a细胞的Ca2+浓度相较于对照组而言仍然显著升高，与单纯TOCP染毒组相比差异没有统计学意义。
(2)TRPA1通道抑制剂HC030031能抑制TOCP导致N2a细胞的Wallerian变性和程序性坏死通路的激活:WesternBlotting检测显示TOCP染毒24h后N2a细胞的SARM1表达量显著升高，NMNAT2和STMN2的表达量显著下降。而利用HC030031干预后，N2a细胞的NMNAT2和STMN2的表达量较TOCP组显著升高，而SARM1的表达量较TOCP组显著降低，提示HC030031能够显著地抑制TOCP诱导的Wallerian变性机制的激活。同时，与对照组相比，TOCP染毒后N2a细胞的p-RIPK1和p-MLKL水平明显升高，而HC030031干预后表达量显著降低，提示TOCP导致的程序性坏死信号通路的激活能够被钙通道TRPA1的抑制剂HC030031抑制。
(3)钙离子络合剂BATPA-AM能抑制TOCP导致的N2a细胞的Wallerian样变性和程序性坏死通路的激活:WesternBlotting检测显示TOCP染毒24h后N2a细胞内的SARM1表达量显著升高，NMNAT2和STMN2的表达量显著下降。BATPA-AM干预后，NMNAT2和STMN2的表达量较TOCP组显著升高，而SARM1的表达量较TOCP组显著降低，提示BATPA-AM能够显著地抑制TOCP诱导的Wallerian变性。此外，BATPA-AM处理能够显著抑制TOCP染毒诱导的p-RIPK1和p-MLKL水平增加，提示TOCP导致的程序性坏死信号通路的激活能够被BATPA-AM所抑制。
(4)RIPK1抑制剂Nec-1可以抑制TOCP染毒后的程序性坏死的激活，但不能缓解细胞内Ca2+浓度的升高:WesternBlotting结果显示，Nec-1干预后，RIPK1和p-RIPK1，p-MLKL的表达量相较于单纯TOCP染毒组显著下降，提示程序性坏死信号通路被抑制。而Ca2+探针结果显示，Nec-1干预后，细胞内钙离子浓度与对照组相比显著升高，与TOCP组相比无显著降低。
结论
1.TOCP染毒激活了SARM1介导的Wallerian样变性机制。
2.TOCP染毒激活了RIPK1-MLKL程序性坏死信号通路。
3.TRPA1通道激活引起的细胞内Ca2+蓄积在TOCP诱导的OPIDN中作为Wallerian样变性和程序性坏死的上游事件发挥作用。
三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate, TOCP)被广泛用于制造业、工业和农业。作为最早被确定的能诱导人类发生迟发性神经病(Organophosphorus-induced delayed neuropathy, OPIDN)的有机磷化合物，TOCP常被用来诱导母鸡和猫等易感动物建立OPIDN实验动物模型。到目前为止，OPIDN的发病机制尚未阐明。OPIDN的主要病理表现为中枢神经长传导束和外周神经轴突的退变，是一种类似于Wallerian变性的病理改变。同时，脊髓前角运动神经元的丢失也与OPIDN的发病密切相关，然而目前临床上以凋亡为基础的治疗手段几乎没有任何进展，提示OPIDN中可能存在其他的细胞死亡形式。因此，深入研究OPIDN中轴突变性和神经元丢失相关的分子事件，不仅能够阐明TOCP诱导迟发性神经病的机制，还能够为临床治疗上寻找新的药物靶点提供依据。
在前期的实验中，本课题组通过TOCP经口染毒母鸡制备了OPIDN动物模型，并使用小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2a，N2a)建立了体外培养细胞染毒模型。本研究拟利用上述整体动物模型和体外细胞模型，检测了Wallerian变性相关蛋白的表达改变和程序性坏死信号通路的激活情况，在此基础上研究TRPA1通道激活介导的Ca2+浓度升高和Wallerian变性以及程序性坏死之间的上下游关系，以期探讨OPIDN中是否既存在神经元轴突的Wallerian样变性，又存在程序性坏死信号通路的激活，而TRPA1通道的激活导致神经元内Ca2+浓度的升高可能作为轴突退变和神经元死亡的上游事件发挥作用。
方法
1.TOCP染毒母鸡OPIDN动物模型和PMSF干预动物模型的建立
OPIDN动物模型的建立。健康成年罗曼母鸡适应性喂养7天后，被随机分为5组，每组5只，实验组经口一次性给予750mg/kg的TOCP，对照组给予相同体积的玉米油，分别在TOCP染毒后1天、5天、10天和21天时处死动物。在此期间，每天观察动物的双下肢活动情况，按照八级步态评分标准对动物OPIDN的临床症状进行评分。每组取3只动物用于WesternBlotting检测，在冰上快速取出坐骨神经和脊髓组织在液氮中冷冻后保存于-80℃。其余2只动物麻醉后，用4％甲醛溶液进行心脏灌注，取脊髓组织固定，进行病理检测和免疫荧光染色。
PMSF干预动物模型的建立:30只健康成年罗曼母鸡在适应性喂养7天后，被随机分为6组，每组5只，对照组给予同体积的玉米油，实验组均提前皮下注射90mg/kg的苯甲基磺酰氟(PMSF)24h后一次性经口染毒750mg/kg的TOCP，在染毒后的0天、1天、5天、10天和21天分别处死动物，冰上取出坐骨神经和脊髓组织后在液氮中快速冷冻并保存于-80℃用作WesternBlotting检测。期间每天对动物的双下肢活动情况进行记录，按照八级步态评分标准对实验动物OPIDN的临床症状进行评分。
2.TOCP染毒N2a细胞体外模型的建立
N2a细胞使用含10％血清的DMEM培养基培养，以5×104个/ml接种于9mm培养皿中，细胞贴壁后将培养液更换为含10μM视黄酸和2％血清的DMEM培养基诱导分化，在48h分化成功后给予TOCP。TOCP的染毒剂量为20μM，干预药物BATPA-AM的剂量为0.5μM，HC030031的剂量为5μM，而Nec-1的剂量为10μM。染毒24h后记录N2a细胞的形态学改变，并收集细胞。
3.N2a细胞轴突损伤观察、细胞内Ca2+浓度检测和免疫荧光检测
(1)N2a细胞轴突的改变:TOCP染毒24h后在显微镜下观察，每个组中随机选取10个视野进行观察和拍照记录(400x)。
(2)细胞内Ca2+浓度的检测:TOCP染毒N2a细胞24h后，在培养皿中加入Fluo-4-AM工作液，在荧光显微镜下观察细胞内Ca2+的染色情况，并将贴壁细胞轻轻吹打制作成细胞悬液，使用酶标仪测定荧光强度并计算各组细胞内Ca2+的浓度。
(3)细胞免疫荧光试验:荧光显微镜下观察N2a细胞中p-RIPK1的表达水平和分布情况。
4.动物组织和细胞内的Wallerian变性相关蛋白和程序性坏死信号通路中的蛋白检测
使用蛋白免疫印迹(Western Blotting)试验检测TOCP染毒和药物干预后动物组织和细胞内的Wallerian变性相关蛋白和程序性坏死信号通路中的蛋白表达量的改变。Wallerian变性相关蛋白包括NMNAT2、SARM1和STMN2，程序性坏死信号通路中的蛋白包括RIPK1、p-RIPK1(S166)、MLKL和p-MLKL(S345)。
4.统计学分析:
采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)法比较样本均数(P＜0.05)。
结果
1.OPIDN动物模型中存在类Wallerian变性和程序性坏死信号通路的激活。
(1)TOCP染毒动物的神经行为学改变:TOCP染毒5天后，实验组动物行走时出现了轻微的不稳和摇晃，随后OPIDN的症状逐渐加重，到15天时动物的行动能力减弱，协调性变差，不愿直立行走，行走时剧烈摇晃甚至跌倒，到18天时所有的动物都完全瘫痪，不能站立，直到21天处死动物时此状态一直没有任何好转或者恢复。而PMSF干预TOCP染毒的实验动物在21天时仍然能够正常行走，没有出现明显的OPIDN症状。
(2)OPIDN动物模型中Wallerian变性机制激活:WesternBlotting检测发现坐骨神经和脊髓组织中SARM1的表达量都显著升高，且NMNAT2的表达量显著降低，而PMSF干预组的坐骨神经中SARM1和NMNAT2的表达水平各组之间的差异没有统计学意义。除此之外，免疫荧光结果显示:在TOCP染毒10天组和21天组的脊髓前角运动神经元中出现了SARM1的高表达和聚集，且与线粒体蛋白TIM23存在共定位。
(3)TOCP染毒动物出现脊髓前角运动神经元的丢失和程序性坏死信号通路的激活:脊髓组织的病理检查结果显示前角运动神经元的数量减少，而WesternBlotting结果显示在脊髓和坐骨神经组织中都能够检测到RIPK1、p-RIPK1和p-MLKL的表达水平显著升高。而PMSF干预组的坐骨神经中上述蛋白的表达量在对照组和染毒组之间无明显差异。
2.TRPA1通道介导的细胞内Ca2+水平升高参与了类Wallerian变性和程序性坏死信号通路的激活。
(1)TOCP染毒和干预药物干预后N2a细胞内Ca2+浓度的检测:Ca2+荧光探针检测结果显示20μMTOCP染毒24h后N2a细胞内的Ca2+水平显著升高，而干预药物BATPA-AM和HC030031使用后均能显著抑制TOCP染毒导致的N2a细胞内Ca2+浓度增加，与TOCP染毒组相比差异具有统计学意义。但Nec-1和TOCP同时处理后N2a细胞的Ca2+浓度相较于对照组而言仍然显著升高，与单纯TOCP染毒组相比差异没有统计学意义。
(2)TRPA1通道抑制剂HC030031能抑制TOCP导致N2a细胞的Wallerian变性和程序性坏死通路的激活:WesternBlotting检测显示TOCP染毒24h后N2a细胞的SARM1表达量显著升高，NMNAT2和STMN2的表达量显著下降。而利用HC030031干预后，N2a细胞的NMNAT2和STMN2的表达量较TOCP组显著升高，而SARM1的表达量较TOCP组显著降低，提示HC030031能够显著地抑制TOCP诱导的Wallerian变性机制的激活。同时，与对照组相比，TOCP染毒后N2a细胞的p-RIPK1和p-MLKL水平明显升高，而HC030031干预后表达量显著降低，提示TOCP导致的程序性坏死信号通路的激活能够被钙通道TRPA1的抑制剂HC030031抑制。
(3)钙离子络合剂BATPA-AM能抑制TOCP导致的N2a细胞的Wallerian样变性和程序性坏死通路的激活:WesternBlotting检测显示TOCP染毒24h后N2a细胞内的SARM1表达量显著升高，NMNAT2和STMN2的表达量显著下降。BATPA-AM干预后，NMNAT2和STMN2的表达量较TOCP组显著升高，而SARM1的表达量较TOCP组显著降低，提示BATPA-AM能够显著地抑制TOCP诱导的Wallerian变性。此外，BATPA-AM处理能够显著抑制TOCP染毒诱导的p-RIPK1和p-MLKL水平增加，提示TOCP导致的程序性坏死信号通路的激活能够被BATPA-AM所抑制。
(4)RIPK1抑制剂Nec-1可以抑制TOCP染毒后的程序性坏死的激活，但不能缓解细胞内Ca2+浓度的升高:WesternBlotting结果显示，Nec-1干预后，RIPK1和p-RIPK1，p-MLKL的表达量相较于单纯TOCP染毒组显著下降，提示程序性坏死信号通路被抑制。而Ca2+探针结果显示，Nec-1干预后，细胞内钙离子浓度与对照组相比显著升高，与TOCP组相比无显著降低。
结论
1.TOCP染毒激活了SARM1介导的Wallerian样变性机制。
2.TOCP染毒激活了RIPK1-MLKL程序性坏死信号通路。
3.TRPA1通道激活引起的细胞内Ca2+蓄积在TOCP诱导的OPIDN中作为Wallerian样变性和程序性坏死的上游事件发挥作用。