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伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）可感染羊（尤其是山羊和绵羊）、马、牛等多种动物和人。该菌感染羊主要引起内脏器官脓肿,以及体表淋巴结干酪样病变为特征的干酪样淋巴结炎（Caseous lymphadenitis,CLA）。近年来,我国关于该病的报道不断增多,部分地区存在该病的羊场高达53%,羊群患病率高达30%-80%,而且一旦遭受伪结核棒状杆菌感染,则极难根除,对养羊业的潜在危害极大,已经成为严重影响我国养羊业健康快速发展的最为重要疾病之一。因此,急需阐明伪结核棒状杆菌感染致病及宿主免疫应答的机制,为有效的防控该病原提供指导。伪结核棒状杆菌感染引起炎症综合反应,以被感染部位炎性细胞因子大量增加为特征。因此,明确伪结核棒状杆菌感染致炎的机理具有重要意义。IL-1α被认为是众多细胞因子中一种极其特殊的多功能蛋白类型分子,可作为核转录因子,在胞内调节相关基因的表达;还能作为“警报素（alarmin）”因子,通过结合胞外IL-1R1受体,促进炎症反应产生,在各种病原性微生物感染和自发炎症及恶性肿瘤等慢性疾病的早期发生发展中扮演着重要的角色,因此IL-1α被认为是一种预防和治疗各种相关慢性疾病的重要标靶。我们前期研究发现,伪结核棒状杆菌感染以NLRP3炎性小体依赖途径介导IL-1β的成熟分泌。虽然同属IL-1家族的细胞因子,但是IL-1α与IL-1β的成熟分泌过程不同,目前,关于伪结核棒状杆菌感染诱导IL-1α成熟与分泌的机制尚不清楚。因此,本试验以小鼠巨噬细胞为研究对象,用伪结核棒状杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞,以此探究伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞诱导IL-1α成熟与分泌的机制。1.伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞对IL-1α成熟与分泌的影响以伪结核棒状杆菌宣汉株（XH02）不同的感染复数（MOI=1,10,50,100）感染小鼠腹腔的巨噬细胞,通过检测感染体系中IL-1α的分泌量,观察不同MOI对IL-1α分泌的影响。进而在MOI=10感染的情况下,分别检测感染细胞IL-1αm RNA表达（实时定量PCR分析）,感染细胞上清中IL-1α的分泌量（ELISA检测）和细胞培养上清中IL-1α成熟体及细胞裂解物中IL-1α前体（pro-IL-1α）表达水平（Western blotting检测）。结果发现,在MOI=1,10和50,伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞IL-1α的分泌量随感染复数增加而增加。重复实验证实,伪结核棒状杆菌感染小鼠巨噬细胞后,被感染细胞IL-1αm RNA表达水平,pro-IL-1α表达水平和IL-1α成熟体分泌量均显著增加。以上结果表明,伪结核棒状杆菌感染可激活巨噬细胞IL-1α表达和成熟分泌。2.磷脂酶D在伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞诱导IL-1α成熟与分泌中的作用磷脂酶D（PLD）是伪结核棒状杆菌最重要的毒力因子之一,与该病原的传播和致病密切相关。为评价PLD在该病原感染致炎反应中的作用,我们分别用伪结核棒状杆菌国际标准株ATCC19410及其pld基因缺失株（ATCC19410Δpld）、临床分离株XH02及其pld基因缺失株（XH02Δpld）感染小鼠腹腔巨噬细胞,分别检测感染细胞IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6 m RNA表达（实时定量PCR分析）,感染细胞上清中IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌量（ELISA检测）和细胞培养上清中IL-1α成熟体及细胞裂解物中IL-1α前体（pro-IL-1α）表达水平（Western blotting检测）。结果发现,与ATCC19410和XH02感染组小鼠腹腔巨噬细胞相比,除XH02Δpld感染巨噬细胞的TNF-α分泌水平减少程度未达到显著水平外,ATCC19410Δpld和XH02Δpld感染巨噬细胞的IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6 m RNA表达及分泌水平均显著下降。Western blotting结果显示,与同源野生菌株相比,pld基因缺失株感染腹腔巨噬细胞后,上清中IL-1α成熟体蛋白表达水平明显下降,但是对细胞裂解沉淀中pro-IL-1α蛋白表达水平无明显影响。综上结果表明,伪结核棒状杆菌PLD参与了该病原感染巨噬细胞介导IL-1α的成熟与分泌。3.NLRP3炎症小体在伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞介导IL-1α成熟与分泌中的作用用伪结核棒状杆菌临床分离株XH02分别感染C57BL/6野生型（WT）、NLRP3炎性小体组分敲除(Asc-/-,Caspase1-/-和Nlrp3-/-)小鼠腹腔巨噬细胞,分别采用ELISA及Western blotting检测感染上清中IL-1α分泌量和成熟体含量及细胞裂解物中pro-IL-1α表达水平。结果发现,伪结核棒状杆菌感染Nlrp3-/-小鼠巨噬细胞后,IL-1α的成熟与分泌较WT小鼠巨噬细胞无明显区别;而伪结核棒状杆菌感染Asc-/-和Caspase1-/-小鼠巨噬细胞中IL-1α的分泌量较被感染的WT小鼠巨噬细胞显著降低,并且上清中IL-1α成熟体表达量也显著降低,但WT、Asc-/-、Caspase1-/-和Nlrp3-/-小鼠细胞裂解沉淀中pro-IL-1α的表达水平均无显著差异。以上结果表明,伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞过程中,ASC和Capase 1,而不是NLRP3分子参与IL-1α的成熟与分泌。4.Ca2+及calpain在伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞介导IL-1α成熟与分泌中的作用为探究胞内Ca2+对伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞介导IL-1α成熟与分泌有无影响,用伪结核棒状杆菌XH02及其pld基因缺失株（XH02Δpld）感染小鼠巨噬细胞,通过Fluo-4 NW试剂盒检测胞内Ca2+浓度变化;进一步在感染后分别加入Ca2+螯合剂EDTA和EGTA+Mg2+,检测感染上清中IL-1α分泌水平（ELISA检测）。结果显示,感染细胞胞内Ca2+浓度随感染时间延长逐渐上升,并在感染后20 h到达顶峰。与XH02感染巨噬细胞相比,XH02Δpld感染细胞的胞内Ca2+浓度极显著降低;XH02感染后加入EDTA和EGTA+Mg2+,感染细胞上清中IL-1α分泌水平显著下降。在无Ca2+环境下,感染细胞IL-1α的分泌水平较有Ca2+的感染细胞显著降低。同样,在XH02Δpld菌株感染巨噬细胞后,加入Ca2+载体A23187,感染上清中IL-1α的分泌水平显著增加。为评价calpain是否参与伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞介导IL-1α成熟与分泌,首先以ATCC19410和XH02感染巨噬细胞,通过Western blotting检测感染上清中α胞衬蛋白（α-fodrin）降解片段（α-fodrin为calpain内源性底物,其降解片段为145k Da）的含量以及细胞裂解沉淀中full-α-fodrin（240 k Da）的表达情况。结果发现,在感染的巨噬细胞上清中α-fodrin降解片段明显增加,而被感染的巨噬细胞及未被感染的细胞裂解沉淀中full-α-fodrin表达无显著差异;进一步用ATCC19410和XH02感染小鼠巨噬细胞,加入calpain抑制剂EST、calpain inhibitorⅢ、calpain inhibitorⅣ和Ca2+螯合剂BAPTA-AM,分别检测感染细胞上清中IL-1α的分泌量（ELISA检测）和细胞培养上清中IL-1α成熟体及细胞裂解物中IL-1α前体（pro-IL-1α）表达水平（Western blotting检测）。结果发现,加入BAPTA-AM,calpain inhibitorⅢ和calpain inhibitorⅣ,IL-1α的分泌量和蛋白表达显著降低;而加入EST后,IL-1α的分泌量及蛋白表达无显著差异。最后分别用ATCC19410、XH02、ATCC19410Δpld及XH02Δpld感染巨噬细胞,检测calpain-1、calpain-2、calcineurin m RNA及蛋白表达水平。结果显示,与未感染组细胞相比,伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞中calpain-1、calpain-2、calcineurinm m RNA及蛋白表达水平均无明显差异。上述结果表明,伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞引起胞内Ca2+浓度显著增加,激活calpain,进而介导IL-1α成熟与分泌。calpain-1、calpain-2和calcineurin可能未参与伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞介导的IL-1α成熟与分泌。综合上述结果,本研究表明伪结核棒状杆菌感染巨噬细胞可激活IL-1α的成熟和分泌,该过程与该病原感染造成的胞内钙离子浓度升高及钙蛋白酶的激活有关,ASC和Capase 1也参与介导IL-1α的成熟与分泌。伪结核棒状杆菌PLD部分参与了该病原感染巨噬细胞介导的IL-1α成熟与分泌。