由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的猪传染性胃肠炎是一种急性肠道传染病,以2周龄以下仔猪呕吐、脱水、严重腹泻,极高发病率和病死率(可达100%)为特征。该病的发生给世界养猪国家带来了巨大的损失。但关于该病毒的分子致病机制尚未完全清楚,且基于TGEV感染宿主细胞的蛋白质组学研究较少。猪睾丸(ST)细胞对TGEV病毒很敏感,常用来增殖、分离TGEV病毒。本研究用ST细胞作为靶细胞,采用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱(2D LC-MS/MS)高通量蛋白质组学技术对TGEV感染和未感染的ST细胞进行比较蛋白质组学分析,获得了TGEV感染宿主细胞差异表达蛋白质组数据,并利用生物信息学方法对差异表达蛋白进行分析,以期发现新的诊断、预防和治疗靶标,为揭示TGEV致病机制奠定基础。具体内容和结果如下:(1)为了确定4重-i TRAQ标记蛋白质组学分析样品的时间,首先应用ST细胞进行TGEV感染试验,对TGEV感染引起的细胞病变效应(CPE)进行观察,并用RT-PCR试验对感染细胞中TGEV基因进行检测,用q RT-PCR对病毒基因组RNA的复制的动态变化进行分析。结果显示,在感染后40~64 h,感染组细胞均出现明显病变;在感染后48 h,80%以上细胞出现典型CPE及细胞中病毒基因m RNA水平达到高峰;感染后64 h,细胞严重病变并出现大量细胞变圆脱落,细胞中病毒基因m RNA水平快速下降,可能与随着病毒作用时间延长,宿主细胞产生免疫应答及感染细胞活力下降有关。为此确定TGEV感染后48 h和64 h细胞样品用于后续蛋白质组学分析。(2)采用i TRAQ标记结合2D LC-MS/MS技术对感染和未感染TGEV的细胞样品进行了蛋白质分离和鉴定,并用Protein pilot 4.0软件对鉴定到的蛋白质进行定量分析,搜库后共获得29 214个不同肽段,鉴定到4 112个可信蛋白。在此基础上,对蛋白表达比值分布进行了分析,确定了差异蛋白所处的范围(比值≤0.25或者比值≥4)。根据这一标准,共筛选到316个显著性差异表达蛋白,其中,与未感染细胞相比,感染48 h引起ST细胞146个蛋白的表达有显著差异,感染64 h引起219个蛋白的表达出现显著差异。该结果显示ST细胞在病毒感染后64 h,发生了较大数量的蛋白质组变化。(3)以所有鉴定到的蛋白为背景,对差异表达蛋白进行GO富集分析。结果显示这些差异蛋白在18类生物过程中显著富集(p≤0.05),主要参与细胞黏附、应激反应、前体代谢物和能量的产生、蛋白质成熟、蛋白复合体组装、免疫系统过程、解剖结构形成、细胞死亡、跨膜转运、细胞运动等生物过程。感染48 h和64 h差异表达蛋白的GO富集分析结果显示,两个时间点的差异蛋白共同影响了6类生物过程,但应激反应、前体代谢物和能量的产生、免疫系统过程、蛋白复合体组装、细胞运动、细胞生长6类生物过程仅在感染后64 h受到了较大影响。参与这些生物学过程的差异蛋白可能与病毒复制、免疫应答、细胞病变等密切相关。(4)为确定差异蛋白质参与的最主要的生化代谢途径和信号转导途径,进一步对差异蛋白进行KEGG pathway富集分析。结果显示在差异蛋白质中显著富集(p≤0.05)的KEGG通路主要匹配在在碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢、脂质代谢类别中的16个通路,感染性疾病相关通路10个,免疫系统相关通路4个,消化及排泄系统相关通路3个,信号分子和互作过程相关通路2个,信号转导相关通路2个等共计61个。参与各种营养物质代谢的相关通路,NOD-like受体信号途径和RIG-I-like受体信号途径2个免疫相关通路,感染性疾病相关通路,TNF和PI3K-Akt 2个信号转导通路,只在感染64 h的差异蛋白中受到显著影响。参与上述途径的差异表达蛋白可能对TGEV感染及猪传染性胃肠炎发病起重要的调控作用。(5)根据差异蛋白的表达变化趋势和GO富集分析结果,挑选4个代表性差异表达蛋白HSP90α、TGFB1/TGF-β1、Caspase-8、DDX58/RIG-1进行了Western blot验证,结果显示其表达规律与蛋白质组数据基本一致,说明质谱鉴定结果是可靠的。这些蛋白参与TGEV感染引起应激反应、细胞死亡、初始免疫应答、细胞蛋白体复合物装配等。本研究首次应用i TRAQ技术,对TGEV感染的宿主应答蛋白质组变化进行分析。据我们目前所知,对于差异表达蛋白的较为全面的生物信息学分析、病毒在快速复制期之后的蛋白质组变化的分析及鉴定的免疫应答相关差异表达蛋白在之前对TGEV感染的ST细胞蛋白质组学研究中没有涉及。本研究鉴定的这些差异表达蛋白体现着宿主ST细胞对TGEV感染的总体反应模式,为从病毒与宿主相互作用角度揭示TGEV的致病机理奠定了良好基础。