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干旱胁迫是限制作物生长和产量的主要因素之一。林木抗旱形态和生理机制及抗旱性评价的研究为我国大地绿化和林业生产提供了大量抗逆材料,分子标记辅助选育机制和技术已在不同程度上取得进展。本研究基于林木抗旱机制和基因功能鉴定的前期积累,研究13种抗旱相关生理指标的生理反应量化评价技术体系;抗旱关键基因DREB2A、WRKY19和XET表达量及其与抗旱生理反应调控关系;DREB2A、WRKY19和XET基因启动子响应干旱、盐渍、低温等顺式作用元件,为揭示林木抗旱生理分子表达调控机制,抗旱林木分子评价体系,抗逆材料精准把控和育种提供理论和技术基础。主要研究结果如下。1.整合林木抗旱生理反应和基因表达,揭示林木抗旱的生理分子调控机制基于搜集我国北方习见林木材料,在北京极端干旱和寒冷地区延庆和潜山区-平原边缘地区顺义赵全营建立田间对比试验林材料,以适应性淘汰存活的林木39种为实验材料,测试13个抗旱相关生理生化指标,包括叶片含水量(LWC)、细胞膜透性(MP)、气孔导度(SC);叶绿素a、b和a+b(Chla、Chlb、Chl a+b)、可溶性糖(SS)、游离脯氨酸(FP)、可溶性蛋白(SP)含量;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性和过氧化物丙二醛(MDA)含量等;以隶属函数建立生理指标变量和生理反应量关系,定量评价所涉林木生理抗旱性。根据隶属函数值将林木生理抗旱性划分为五级,Ⅰ级,AMF≥0.6,3种:单叶刺槐、叶底珠和五角枫;Ⅱ级,AMF0.5～0.6,11种:洋白蜡、栾树、杂种白杨、榆树、文冠果、改良香花槐、美国黄栌、芍药、宁杞五号、宁杞菜和黑果枸杞;Ⅲ级,AMF0.4-0.5,13种:山杏、白蜡、北美白杨、匈牙利刺槐、’凤丹’、四倍体刺槐、山桃、大白柠条、’乌龙捧盛’、美洲黑杨、苹果枣、野山楂和山楂;Ⅳ级,AMF0.3-0.4,11种:金昌一号、大叶榆、沙枣、伍兹玫瑰、柠条、爆竹柳、沙地柏、紫斑牡丹、白刺、日本皂角和油松;V级,AMF<0.3,1种:宁杞七号。基于基因功能鉴定基础,克隆分析所涉及39种林木的DREB2A、WRKY19和XET含保守区基因序列特征、测定分析基因表达量及其与抗旱生理反应量关系发现,DREB2A、WRKY19和XET基因表达与SOD、POD活性、MP大小、SS含量的调节有关。科属内植物的DREB2A、WRKY19和XET基因表达量与生理指标相关性分析表明,刺槐属WRKY19基因表达与SS含量、XET基因表达与SOD活性相关;芍药属WRKY19基因表达与SC相关、XET基因表达与FP和SC相关;杨属DREB2A基因表达MP大小、XET基因表达与CAT活性相关;枸杞属XET基因表达与SC和FP含量及SOD活性相关。2.克隆’凤丹’PoDREB2A、PoWRKY19和PoXET基因启动子鉴定顺式作用元件功能,发现渗透、盐、低温等胁迫响应元件。芍药属牡丹组植物’凤丹’抗旱性强和适应性广,’凤丹’PoDREB2A基因表达量最高,PoWRKY19基因调节气孔导度SC和PoXET基因调节FP和SP含量有关,三个基因在’凤丹’抗旱性形成中发挥作用。PoDREB2A、PoWRKY19和PoXET基因启动子序列长度分别为2342 bp、1974 bp和2025 bp。生物信息学分析表明,三个启动子均含有干旱、盐渍、低温和ABA信号响应元件。5’端缺失片段构建GUS基因表达载体转化烟草定性和定量分析表达活性表明,PoDREB2A基因启动子在-1541 bp～-1833 bp、-1137 bp～-1541 bp区域有干旱响应元件待定元件和 CANNTG,在-1833 bp～-2240 bp、-1028 bp～-1137 bp 和-679 bp～-1028 bp区域有盐渍响应元件待定元件和GRWAAW,在-1541 bp～-1833 bp区域有低温响应待定元件,在-1028 bp～-1137 bp区域有ABA响应元件ACACNNG。PoWRKY19基因启动子在-1264 bp～-1461 bp区域和-422bp～-718 bp有干旱响应元件 CANNTG、CANNTG 和 CNGTTR,在-1461 bp～-1901 bp、-953 bp～-1264 bp和-718 bp～-953 bp区域有盐渍响应元件GRWAAW和待定元件,在-1264 bp～-1461 bp和-422 bp～-718 bp区域有低温响应元件CANNTG,在-422 bp～-718 bp区域有ABA响应待定元件。PoXET基因启动子在-1173 bp～-1570 bp和-425 bp～-591 bp区域有干旱响应元件CATGTG和CANNTG,在-1173 bp～-1570 bp和-425 bp～-591 bp区域有盐渍响应元件GRWAAW和待定元件,在-1774 bp～-2025 bp和-125 bp～-425 bp区域有低温响应元件CANNTG,在-425 bp～-591 bp区域有低温响应待定元件,在-1570 bp～-1774 bp、-591 bp～-1173 bp 和-125 bp～-425 bp 区域有 ABA 信号响应元件 CATGCA、ACACNNG。3.发明“植物叶片总RNA提取方法”获发明专利授权ZL201410444486.8,解决木本植物核酸提取干扰严重难题富含多糖多酚的植物叶片,经连续两次裂解,水饱和酚与氯仿混合溶液抽提,异丙醇沉淀总RNA。无需水浴、低温离心机,避免传统沉淀法中LiCl残留影响后续实验,可以满足RNA反转录PCR和qPCR等实验需要。以上结果为林木抗旱性形成的生理机制及其分子调控机制深入研究获得启示;为抗旱优质林木分子生理选育应用和育种提供理论和技术途径。