肿瘤现在已经成为人类死亡的第一大疾病,它的转移途径一直是科学研究的方向,其中,淋巴转移是恶性肿瘤最常见、最重要的转移扩散途径之一,抑制淋巴转移通路是治疗肿瘤新的研究方向。腹部肿瘤易发生腹腔转移,同时伴有腹水的大量增加,50年代曾有学者对腹水的吸收和循环做过形态学研究,即提出在横膈上有筛状孔的概念,腹水通过筛状孔进入横隔内淋巴管,进入淋巴循环,进入淋巴循环前,它既不属于淋巴循环,也不属于血液循环,因而提出了“脉管外体液通路”的概念,但仅仅限于形态学概念,对其超微结构及腹水循环的调节机制,特别是在病理情况下的形态学改变和腹水循环的调节机制的研究甚少。在肿瘤腹腔转移时,通过脉管外体液通路进入横膈内淋巴循环的腹水大量增加,同时伴有肿瘤细胞的淋巴转移,脉管外体液通路的形态结构必然发生相应的改变,特别是横膈腹膜间皮细胞的形态结构和机能调节也相应发生改变,因此我们应用各种形态学研究技术和分子生物学技术,将肝癌腹水瘤细胞(H22细胞)小鼠腹腔种植,建立肿瘤腹水模型,对小鼠横膈的形态学改变,特别是间皮细胞和间皮下组织结构的改变进行了系统的观察,目的就是在超微结构和分子水平,探讨横膈脉管外体液通路的病理改变,检测Hsp90、VEGF-C、LYVE-1的蛋白及基因表达的变化,探讨脉管外体液通路病理改变的分子机制,同时应用17-AAG和顺铂联合用药干预,探讨对脉管外体液通路的保护机制,为肿瘤淋巴转移的治疗提供新的治疗方向。血管内皮生长因子(VEGF)家族包括VEGF-A、VEGF-B、胎盘生长因子(PIGF)、VEGF-C、VEGF-D、和它们的受体VEGFR-1、 VEGFR-2、VEGFR-3。其中VEGF-C、VEGF-D是主要的淋巴管生成因子,它们及其受体VEGFR-3将成为肿瘤淋巴转移和预后评估的重要因子,为抗肿瘤淋巴转移治疗提供新的研究方向。淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)是一种膜蛋白,表达在微淋巴管的内皮细胞上,分布在淋巴管的管腔面以及基底面。它的主要作用是协助透明质酸从周围组织穿透淋巴内皮并转运至淋巴管的淋巴液。它们在血管和淋巴管的表达增高与肿瘤细胞的转移有密切的关系。热休克蛋白(Hsp)是细胞在应激原特别是环境高温下所产生的一组蛋白质,具有高度保守性,有多种功能,作为分子伴侣可防止蛋白凝集从而调节细胞的生存和死亡。热休克蛋白90作为分子伴侣参与调控、维持细胞内多种蛋白的构象和功能,以帮助细胞在应激环境下正常生长。近年研究表明很多癌基因蛋白均为Hsp90的作用靶点,因此,抑制Hsp90的功能将促进这些癌基因蛋白的降解,有助于癌症治疗。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamio-17-desmethoxygeldanamycin,17-AAG)是一种热休克蛋白90(HsP90)抑制剂,能够靶向性抑制肿瘤源性的HsP90,抑制热休克蛋白90的功能,通过多条细胞传导通路使其效应蛋白及其关键调节蛋白降解,从而使细胞生长、分化受抑制,引起细胞凋亡,抑制肿瘤生长。体内外实验也证实了Hsp90抑制剂的抗肿瘤活性,其中17-AAG正在进行临床试验。多项研究已经证实17AAG可以对肿瘤细胞有很强的抑制作用,特别和传统的化疗药物联合应用可协同发挥抗肿瘤作用。在本研究中,我们运用免疫组织化学染色检测LYVE-1、VEGF-C、 HsP90的表达；荧光实时PCR测定LYVE-1mRNA、VEGF-C mRNA、HsP90mRNA的表达；Western blot检测LYVE-1、VEGF-C、HsP90蛋白表达。探讨横膈组织LYVE-1、VEGF-C的表达与HsP90的关系,为肿瘤淋巴转移的治疗提供新的治疗方向。本实验还在在上述动物试验的基础上,应用纯系人间皮细胞株HMrSV5于体外在HepG2上清液中培养,观察间皮细胞的形态及凋亡的变化,检测HsP90及LYVE-1、VEGF-C的蛋白与基因表达变化,为在动物体内实验提供进一步的实验支撑。第一部分正常小鼠和肝癌腹水瘤模型小鼠横膈形态学研究目的：既往对横膈淋巴循环尤其是对肿瘤腹水状态下,横膈结构变化的研究甚少。为此,我们应用小鼠腹腔注射H22方法成功地建立了癌性腹水动物模型,进一步观察横膈的结构变化情况,为抑制肿瘤淋巴转移提供形态学基础。方法：1采用完全随机的方法将雌性BALB/c小鼠20只,SPF级,体重(20-21)g,分为对照组10只,模型组10只,①对照组,腹腔注射生理盐水0.2m1/只,隔日、1次；②模型组小鼠腹腔注入H22腹水瘤细胞悬液0.2m l/只。以上两组10天后,灌流固定取横膈组织,应用光镜技术、扫描电镜及透射电镜技术观察各组超微结构变化。2墨汁腹腔注射。正常小鼠腹膜腔内注射10%墨汁溶液2-5ml,0.5-2小时后,向腹膜腔内注射固定液10ml,15分钟后断头处死小鼠,游离横膈,用缓冲液漂洗,直接在体式显微镜下观察。结果：1HE染色结果对照组小鼠横膈腹膜面由一层扁平上皮细胞组成,排列紧密,与肌组织紧密相贴,胞质较少,核小,呈椭圆形。模型组横膈的上皮细胞明显增高,呈球形或立方形,排列紊乱,部分部位缺失。细胞核较大,呈圆形。表面有肿瘤细胞附着。上皮细胞下结缔组织大量增生,内有许多不规则管腔,可见大量肿瘤细胞浸润。2用墨汁腹腔注射和免疫荧光观察,可以观察到横膈淋巴管和血管的分布不同,淋巴管呈放射状分布,表达部位较浅,分布在上皮下的结缔组织中,而血管表达较深,呈树枝状嵌插在肌纤维之间。3扫描电镜结果扫描电镜与NaOH消化后扫描电镜对照观察,对照组横膈间皮细胞表面由大小两种细胞呈条带状交替性规则分布：一种为极其扁平的细胞,直径约为20微米,覆盖横膈大部分表面,细胞表面有短小的微绒毛存在,细胞边界清晰可见,相邻细胞连接紧密,其间无腹膜孔分布。另外一种细胞为较高的立方形细胞,直径大约10-12微米,细胞积聚呈条索状放射分布,细胞间可见较多腹膜孔分布。经NaOH消化后扫描电镜观察,发现其下结缔组织规则排列,分布有大量圆形、椭圆形的筛状孔,筛状孔或单独存在或积聚成筛状斑(macula cribriformis)。高倍扫描电镜下为网状纤维交织形成,可看到巨噬细胞和红细胞穿过；而扁平细胞下则无筛状孔分布,由密集成束的胶原纤维构成。上述两种细胞呈条带状交替性相间分布。模型组小鼠横膈腹膜面大小两种细胞的条带状分布紊乱,或已无两种细胞条带状分布,代之以大量立方形细胞,且排列不规则,表面附着大量的肿瘤细胞,立方形细胞间可见大量腹膜孔分布,孔径变大,可见肿瘤细胞在孔间出入。筛状孔、筛状斑数量显著增多,呈弥散分布。4透射电镜结果透射电镜下,对照组横膈腹膜面由一层扁平上皮细胞组成,细胞紧密相连,扁平的胞质覆盖着横膈腹膜面的大部分,间皮细胞与肌组织间有薄层少量结缔组织。模型组透射电镜下可见横膈腹膜面上皮细胞呈高矮不等的立方形,胞质内细胞器丰富,多分布于胞质较厚处,可见高尔基复合体、部分粗面内质网扩张及大量的胞质空泡。上皮细胞下结缔组织大量增生,上皮细胞下层明显增厚,内有小血管和淋巴管,并见大量肿瘤细胞浸润及肿瘤细胞穿越腹膜孔和筛状孔结论：我们观察到横膈脉管外体液通路的存在,横膈膜腹膜面上皮细胞由扁平细胞和立方形细胞组成,两种细胞呈条带状交替性相间分布,立方形细胞间有腹膜孔存在,其下结缔组织有筛状孔,筛状孔或单独存在,或积聚成筛状斑,腹水通过腹膜孔和筛状孔进入其下小淋巴管。在肿瘤腹水状态下,横膈膜超微结构发生改变,腹膜面几乎由立方形细胞覆盖,腹膜孔和筛状孔及其下小淋巴管大量增生,腹水及肿瘤细胞通过此通路进入淋巴管。第二部分17AAG对肝癌腹水瘤模型小鼠横膈形态学改变及淋巴相关因子的影响目的：通过形态学技术观察H22细胞腹腔种植模型小鼠横膈在17-AAG等药物干预下的形态学变化,通过免疫组化、Western blot、荧光实时PCR测定淋巴管相关因子LYVE-1、VEGF-C及HSP90蛋白与基因的表达,探讨上述改变的分子调节机制与17-AAG干预的机制。方法：采用完全随机的方法将雌性BALB/c小鼠50只,SPF级,体重(20-21)g,分为对照组10只,模型组40只。模型组小鼠腹腔注入H22腹水瘤细胞悬液0.2ml。接种次日,随机将小鼠分为模型对照组、17-AAG组、顺铂组、17AAG+顺铂组,每组10只。接种24h后开始给予干预。①对照组,腹腔注射生理盐水0.2m1/只,隔日1次；②模型组,腹腔注射生理盐水0.2m1/只,隔日1次；③17-AAG组,腹腔注射10mg/kg17-AAG0.2ml/只,隔日一次；④顺铂组,腹腔注射4mg/kg(?)顺铂,0.2m1/只,隔日1次；⑤17-AAG与顺铂联用组：腹腔注射4mg/kg (?)顺铂,0.2m1/只,隔日腹腔注射17-AAG10mg/kg,0.2ml/只。10天后灌流固定,取膈肌组织用光镜技术、扫描电镜及透射电镜技术观察各组超微结构的变化。免疫组织化学染色技术观察LYVE-1、VEGF-C、HsP90的蛋白表达；荧光实时PCR技术测定LYVE-1mRNA、VEGF-C mRNA、HsP90mRNA的表达。Western blot技术检测LYVE-1、VEGF-C、HsP90的蛋白表达。结果：1形态学观察结果对照组与模型组形态改变同第一部分,17-AAG+顺铂联合干预组可见小鼠横膈间皮细胞及上皮细胞下结缔组织改变较接近于对照组,而单独应用17AAG组横膈形态学改变也有明显改善。2免疫组化染色结果与对照组比较,模型组横膈膜组织中LYVE-1、VEGF-C、HsP90阳性表达显著增多(阳性面积：0.464±0.011、0.484±0.009,0.494±0.009,p<0.05)。而顺铂组、17AAG组、顺铂+17AAG组均显著减少。3荧光RT-PCR结果：与对照组比较,模型组横膈中LYVE-1、VEGF-C、HsP90mRNA表达显著上调(p<0.05)。顺铂+17AAG组横膈中LYVE-1、VEGF-C、 HsP90mRNA表达较模型组显著降低(p<0.05),顺铂组、17AAG组有所降低。4Western blot表达结果：与对照组比较,模型组横膈LYVE-1、VEGF-C、HsP90蛋白表达显著增加(p<0.05)。各治疗组LYVE-1、VEGF-C、HsP90蛋白表达较模型组显著降低(p<0.05)；顺铂+17AAG组降低最明显。结论：在肿瘤转移腹水状态下,横膈LYVE-1、VEGF-C、HsP90蛋白与基因表达上调,17-AAG等药物干预后表达下调。推论：17AAG、顺铂对横膈LYVE-1、VEGF-C、HsP90有抑制作用,17AAG+顺铂干预组对横膈的保护作用更明显,17AAG与顺铂对抑制肿瘤淋巴转移有叠加作用。第三部分人肝癌肿瘤细胞上清液对人腹膜间皮细胞株HMrSV5的体外影响及药物干预的研究目的：将人腹膜间皮细胞株HMrSV5在新鲜DMEM和无血清细胞株HepG2培养上清中培养(4ml/25cm2),同时进行17AAG及顺铂药物干预,应用免疫组化、Western blot、荧光实时PCR技术检测LYVE-1、VEGF-C、 HsP90蛋白与基因的表达,进而研究17AAG与顺铂联合用药在体外环境下对HMrSV5细胞的影响。方法：将体外培养的人间皮细胞株HMrSV5分为5组：(1)正常HMrSV5组；(2)模型组(HepG2培养上清刺激组)；(3)顺铂干预组(模型组+顺铂(5μg/ml));(4)17AAG干预组(模型组+17AAG (5μg/ml));(5)联合干预组(模型组+顺铂(5μg/ml)+17AAG (5μM))。待模型组细胞贴壁后,加入治疗药物,继续培养48h,然后弃上清,冷PBS洗一次,加入总RNA抽提试剂TRIzol Reagent (2ml/25cm2),待细胞完全裂解后,转移到1.5ml离心管,-80℃冻存。用细胞免疫荧光组化法观察细胞的凋亡变化。用免疫组化、Western blot、real time PCR来技术观测LYVE-1、 VEGF-C、HsP90的蛋白及基因表达的变化。结果：1细胞的形态及荧光结果应用Hoechst33258与标记CY3的HSP90、LYVE-1、VEGFC蛋白抗体进行双染色,蛋白阳性表达部位为细胞浆内红色荧光,细胞核呈蓝色。正常对照组细胞呈梭形,胞浆内红色荧光弱,细胞核呈蓝色,模型组细胞形态不规则,融合成团状,各组蛋白阳性表达增强,胞浆内红色荧光加深,细胞核呈蓝色。可见少量凋亡的细胞核呈致密浓染,呈亮蓝色。17AAG、17AAG+顺铂干预组各组蛋白阳性表达与模型组相比较细胞浆内红色荧光均变浅,较多细胞核呈亮蓝色荧光,死亡细胞个数明显减少。2免疫组化染色结果与对照组比较,模型组中LYVE-1、VEGF-C、HsP90阳性表达显著增加(阳性面积：0.465±0.010、0.303±0.009,0.265+0.011,p<0.05)。顺铂、17AAG、17AAG+(?)顺铂干预组中减少。3基因表达结果与对照组比较,模型组中LYVE-1、VEGF-C、HsP90mRNA表达显著上调(p<0.05)。17AAG+顺铂干预组LYVE-1、VEGF-C、HsP90mRNA表达较模型组显著下调,差异有统计学意义(p<0.05)。4蛋白表达结果与对照组比较,模型组LYVE-1、VEGF-C、HsP90蛋白表达上调,差异有统计学意义(p<0.05)。各治疗组LYVE-1、VEGF-C、HsP90蛋白表达较模型组下调,差异有统计学意义(p<0.05)。结论：在体外,17AAG、顺铂及联合用药干预情况下,受HepG2上清液刺激的人间皮细胞株(HMrSV5) LYVE-1、VEGF-C的蛋白表达降低。17AAG与顺铂对肿瘤细胞的作用有叠加效应。17AAG可能通过抑制HsP90活性增强抑制LYVE-1、VEGF-C的蛋白表达。