目的：观察含补肾中药鼠血清对人胚胎干细胞体外分化为类卵巢颗粒细胞的影响及可能的相关机制　　第一部分：人胚胎干细胞体外分化为类卵巢颗粒细胞潜能的研究　　方法：　　人胚胎干细胞H9生长在饲养层细胞上形成克隆团，转入超低吸附板形成拟胚体，拟胚体（加入BMP4，WNT3A，activin-A，bFGF）培养5天后细胞分组贴壁诱导分化7天，诱导因子组加入诱导因子，阴性对照组用干细胞完全培养液，将干细胞拟胚体定向诱导分化为类卵巢颗粒细胞；在诱导分化的不同时间段，显微镜下观察细胞形态学变化，评价诱导分化的细胞形态学是否与人颗粒细胞相似，用免疫荧光染色及RT-PCR检测卵巢颗粒细胞标志物的表达来鉴定诱导分化的细胞是否为颗粒细胞，酶联免疫法检测检测细胞培养液中FSH刺激前后E2的含量，评价分化后的细胞的内分泌功能，实验重复三次。　　结果：诱导分化后的H9细胞形态学与人颗粒细胞两者在形态学上相似；细胞免疫荧光染色结果:诱导因子组的细胞表达较强的人卵巢颗粒细胞标志物的荧光标记；分化后细胞对颗粒细胞特异性标志物的mRNA表达增强；诱导因子组细胞培养液中E2的浓度逐渐升高，在FSH作用下培养液中E2浓度明显升高，与人颗粒细胞相似。而阴性组无论是细胞形态还是颗粒细胞标志物表达和E2的分泌都没有明显的变化。　　小结：人胚胎干细胞H9在体外加入诱导因子后具有分化为类卵巢颗粒细胞的潜力；因此，H9可作为评价补肾中药鼠血清对人胚胎干细胞体外分化为类卵巢颗粒细胞的影响的研究平台。　　第二部分：含补肾中药鼠血清对人胚胎干细胞体外分化为类卵巢颗粒细胞影响的研究　　方法：　　1、各类含补肾中药鼠血清的制备：在体重均一的情况下随机将60只大鼠分成6组：22号药组、23号药组、24号药组、25号药组，26号药组、27号药组，每组10只，雌雄各半。空白组大鼠灌服蒸馏水，补肾中药组大鼠分别灌服对应号码的中药，给药剂量均为5.0g/kg，给药容量均为20ml/kg。分别于给药后90min股动脉取血，血液静置2小时后，3000rpm离心15min，分离各组血清，HPLC分析血清，过滤除菌，-80℃保存备用。　　2、含组补肾中药鼠血清诱导人胚胎干细胞体外分化为类卵巢颗粒细胞影响的研究：人胚胎干细胞形成克隆团、拟胚体（同上）后分组贴壁诱导分化，各组加入2％含补肾中药鼠血清定向诱导分化7天；设Factor组为阳性对照组，Medium组为阴性对照组，在诱导分化的不同时间段（同第一部分）细胞形态学观察、免疫荧光染色及RT-PCR检测颗粒细胞标志物鉴定分化后的细胞以及ELISA检测细胞培养液中FSH刺激前后E2的含量，评价分化后细胞的内分泌功能。统计学分析比较各组参数之间的差异，实验重复两次。　　结果：含补肾中药鼠血清诱导分化后细胞形态学与人颗粒细胞在形态学上相似，各组补肾中药鼠血清诱导分化的细胞能不同程度的表达人卵巢颗粒细胞标志物的免疫荧光标记；分化后的各组细胞对颗粒细胞特异性标志物mRNA表达增强，以25号、26号含补肾中药鼠血清组的细胞表达尤为显著；各组细胞（含23、25、26号、27号补肾中药血清组）培养液中E2浓度均高于Factor组，在FSH作用下25、26号补肾中药血清组诱导的细胞培养液中E2浓度升高尤为显著(P<0.05)。　　小结：补肾中药具有在体外诱导人胚胎干细胞向卵巢颗粒细胞分化的能力，诱导分化后的类卵巢颗粒细胞有分泌E2的功能。6个样品中有4个样品诱导的细胞具有分泌E2功能，FSH刺激下2个样品诱导的细胞分泌E2功能尤为显著。　　第三部分：含补肾中药鼠血清诱导人胚胎干细胞体外分化为类卵巢颗粒细胞的机理研究　　方法：选择上述实验中：细胞培养液中E2浓度升高且在FSH作用下E2水平升高尤为显著的、对颗粒细胞特异性标志物的mRNA表达显著增强的25号、26号含补肾中药鼠血清作为进一步的研究对象；细胞培养及拟胚体形成方法同第一、第二部分，在拟胚体贴壁后分别加入25号、26号补肾中药鼠血清，在分化的第0天、第3天、第5天，收集细胞，RT-PCR检测两组补肾中药诱导的细胞分化后卵巢颗粒细胞特异性基因FSHRmRNA、CYP19A1mRNA、AMHmRNA以及通路相关的BMP6mRNA、SMAD8mRNA、bFGFmRNA的表达，实验重复两次。　　结果：与第0天比较含25号、26号补肾中药鼠血清体外诱导人胚胎干细胞拟胚体贴壁分化3天细胞BMP6mRNA、SMAD8mRNA的表达显著升高，第5天下降；而两组贴壁分化第0天到第5天卵巢颗粒细胞特异性标志物FSHRmRNA、CYP19A1mRNA、AMHmRNA以及bFGFmRNA表达均持续升高。　　结论：综合以上实验结果，我们可以得出一个结论：补肾中药复方能在体外促进卵巢颗粒细胞的分化，BMP/Smads信号通路是补肾中药促进人胚胎干细胞H9体外诱导分化为类卵巢颗粒细胞的可能通路之一；含25、26号补肾中药鼠血清通过BMP/Smads信号通路的传导，促进人胚胎干细胞H9体外诱导定向分化，分化的细胞具备类似人颗粒细胞的功能。这将为从细胞和分子水平来阐明补肾中药在治疗人类生殖功能障碍疾病（如卵巢早衰、卵巢储备功能下降、多囊卵巢综合征等）的药理作用机制提供实验依据。同时，这个研究结果可能推进传统中医与现代生殖医学相结合的临床实践。