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多细胞生物体内许多控制组织自稳的机制与凋亡有关，凋亡信号转导途径障碍在肿瘤发生、发展中具有重要作用。由于化疗、放疗主要通过诱导凋亡而发挥抗瘤效应，故凋亡信号转导障碍可能影响肿瘤细胞对治疗的敏感性。目前已明确，凋亡途径由促进或抑制Caspase级联反应的基因所控制，因此相关调控因子表达或功能失调可造成凋亡抵抗。探索凋亡信号途径中参与凋亡抵抗的靶分子并对其进行调控，将可能直接干预肿瘤对化疗药物所致凋亡的敏感性。 凋亡信号转导主要涉及死亡受体和线粒体途径，二者最终的共同通路均为激活半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)，通过裂解细胞内相应底物，导致特征性的凋亡生化和形态学改变。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一类含有杆状病毒IAP重复序列(Baculoviral IAP repeat，BIR)结构域的蛋白家族，其包括XIAP、cIAP-1、c-IAP2、survivin等成员，可通过抑制Caspase活性而阻断凋亡进程。在IAP家族成员中，XIAP被认为是最有效的Caspase抑制因子，能与起始Caspase-9和效应Caspase-3、-7直接结合并抑制其活性，从而阻断凋亡信号途径的终末阶段。已有多篇文献报道，IAP（尤其是XIAP）在多种肿瘤细胞高表达，并与卵巢癌及肺癌化疗抵抗相关。 IAP可被线粒体来源的促凋亡因子Smac/ DIABLO(second mitochondrialactivator of caspase/direct IAP binding protein with low PI)所拮抗。成熟Smac通过前4个氨基酸(AVPI)与IAP的BIR结构域表面凹槽结合，解除IAP对效应Caspase的抑制作用，从而促进凋亡进展。因此，能否通过上调Smac表达降低凋亡抵抗信号，增强肿瘤对化疗药物所致凋亡的敏感性，从而提高化疗疗效，此乃值得深入探讨的课题。 胰腺癌是一种消化道恶性肿瘤，其早期诊断和确诊困难，且对化疗不敏感，预后亦较差。文献已报道，胰腺癌细胞常出现凋亡调控蛋白表达改变或突变。因此，探索与胰腺癌细胞化疗抵抗性相关的凋亡调控分子，可能为制定胰腺癌治疗的新策略提供重要线索。 迄今，尚未见有关XIAP、Smac与胰腺癌化疗抗性相关的研究。为此，本课题开展如下研究:①观察化疗药物诱导胰腺癌细胞凋亡过程中XIAP、Smac表达的改变，并探讨其与胰腺癌化疗抵抗的相关性;②构建pEGFP-N1/Smac真核表达载体，观察胞浆过表达成熟Smac活性蛋白对化疗药物所致胰腺癌细胞凋亡的影响，并探讨其机制;③化学合成含目的蛋白功能结构域的SmacN端7肽，将其与可透过胞膜的载体肽相连接，用于靶向下调胞内XIAP表达，探索其提高胰腺癌细胞对化疗药物敏感性的可能性。 一、凋亡抑制蛋白XIAP和促凋亡因子Smac在胰腺癌化疗抵抗中的作用 借助Hoechst33258染色和流式细胞术，检测顺铂或5-FU对Panc-1（化疗抵抗）和BXPC-3（化疗相对敏感）细胞的致凋亡作用;借助胞浆染色，分析化疗药物对两种癌细胞胞内XIAP表达的影响;通过Western-blot，观察化疗药物对两种癌细胞胞浆内成熟Smac表达水平的影响。 实验结果显示: 1.与BXPC-3细胞相比，Panc-1细胞对顺铂或5-FU的IC50明显升高，提示Panc-1细胞的化疗抵抗性较强。 2.顺铂或5-FU可诱导Panc-1和BXPC-3细胞出现典型的凋亡细胞特征，且凋亡率与药物浓度和作用时间呈依赖性;顺铂和5-FU所致Panc-1细胞凋亡率明显低于BXPC-3(p＜0.01)。 3.Western blot分析显示:Panc-1细胞高表达XIAP;与Panc-1细胞相比，BXPC-3在化疗药物作用下其胞浆内XIAP水平下降更为明显;凋亡的BXPC-3细胞释放入胞浆内成熟Smac蛋白水平明显高于Panc-1细胞。 上述结果表明:XIAP高表达以及线粒体释放入胞浆的成熟Smac活性蛋白不足可能与Panc-1细胞化疗抵抗有关。提示:线粒体释放Smac以及XIAP表达下调，可能是决定胰腺癌化疗敏感性的重要因素;XIAP-Smac信号途径与胰腺癌细胞化疗抵抗有关。 二、胞浆型Smac真核表达载体的构建及胞浆过表达Smac促进化疗药物所致胰腺癌细胞凋亡 通过RT-PCR获得成熟Smac cDNA（不含线粒体定位序列），定向克隆入真核表达质粒载体pEGFP-N1，经转化、筛选及酶切，借助PCR和DNA测序鉴定重组体pEGFP-N1/Smac。利用脂质体将pEGFP-N1/Smac转染Panc-1细胞，借助FCM和荧光显微镜检测Smac-EGFP绿色荧光融合蛋白表达。采用PI染色，借助FCM观察胞浆过表达成熟Smac对Panc-1细胞增殖周期和凋亡的影响，Western-blot分析凋亡相关分子XIAP、Caspase-3表达水平。 结果显示: 1.经限制性酶切、PCR和测序鉴定，证明构建成功胞浆型Smac重组质粒pEGFP-N1/Smac;将其转染化疗抵抗Panc-1细胞，借助荧光显微镜、FCM观察转染细胞显示绿色荧光，表明Smac-EGFP绿色荧光融合蛋白在胞浆内成功表达。 2.FCM细胞周期分析显示:与未转染及转染空载体的Panc-1细胞相比，转染pEGFP-N1/Smac使G0/G1期细胞比例明显增高(p＜0.05)，表明胞浆过表达成熟Smac可导致明显的G0/G1期阻滞。 3.与转染空载体pEGFP-N1的Panc-1细胞相比，转染pEGFP-N1/Smac可明显下调Panc-1细胞XIAP表达水平，促进效应Caspase-3活化，显著提高顺铂和5-FU所致的细胞凋亡率(p＜0.01)。 以上结果表明:胞浆内成熟Smac蛋白表达上调，可通过有效下调XIAP表达而干预细胞凋亡信号转导途径，促进化疗药物所致的凋亡。上述结果还从另一个角度提示，XIAP是克服癌细胞化疗抵抗的潜在靶分子。此外，胞浆过表达成熟Smac也可能通过阻滞胰腺癌细胞于G0/G1期而抑制细胞增殖，从而发挥抗肿瘤作用。 三、Smac N端活性肽靶向下调XIAP提高胰腺癌细胞化疗敏感性 化学合成SmacN端7肽并与果蝇触角转录因子穿透序列相连接，使之具有可穿越细胞膜而进入胰腺癌Panc-1细胞的特性。借助共沉淀实验，观察SmacN7合成肽与细胞内XIAP的相互作用;借助流式细胞术检测SmacN7合成肽与顺铂、5-FU联用对Panc-1细胞凋亡的影响，并借助Western-blot观察XIAP表达水平的改变;借助四甲其偶氮唑蓝(MTT)法，检测应用SmacN7合成肽对Panc-1细胞化疗药物敏感性的影响。 结果显示:SmacN7融合多肽能透过细胞膜，并与内源性XIAP结合;与药物单用组相比，100μM和500μM SmacN7合成肽能显著增强顺铂或5-FU所致Panc-1细胞凋亡率(p＜0.05);SmacN7合成肽与化疗药物联用，能明显下调Panc-1细胞XIAP表达水平，降低顺铂、5-FU所致的药物半数抑制浓度(IC50)（分别达1.98倍、2.62倍）。 上述结果表明:含目的蛋白功能结构域的Smac小分子活性肽能模拟蛋白-蛋白间相互作用，靶向下调胰腺癌Panc-1细胞表达XIAP，逆转癌细胞对化疗药物致凋亡作用的抵抗性。本研究为研制抗胰腺癌的肽类药物提供了新思路。