论文部分内容阅读
目的:不稳定型心绞痛(Unstable angina,UA)是介于稳定型心绞痛和急性心肌梗死之间的一组临床症状。其起病急,进行性加重,如不及时诊断治疗易发展为心肌梗死,是冠心病中比较严重的一种类型。以往从流行病学角度对冠心病的危险因素进行管理,其发病率仍居高不下,说明仍有未知的因素影响着UA的发病过程,故探索UA发生相关的新型分子标志物及其作用机制尤为重要。microRNAs(miRNAs)作为一种小分子调控RNA通过与靶信使RNA(mRNA)发生互补结合,使靶mRNA降解或抑制其翻译过程,在转录后水平调控基因的表达。研究发现miRNAs参与调节机体组织细胞的生长、发育、分化、凋亡、坏死、肿瘤形成等多种生理病理过程。近年来研究报道miRNAs能稳定存在于血浆等组织液中,被称为循环miRNAs,血浆miRNAs表达谱特征变化与疾病的病理学改变相关,揭示循环miRNAs分子可作为一种疾病诊断、预后判断的新型标志物。miR-29b-3p是miR-29家族的一员,已被证实能够抑制心肌纤维化和血管平滑肌钙化,参与心血管发育,与心血管疾病的调节密切相关,而miR-29b-3p与UA的作用关系尚未见文献报道。本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分别检测不稳定型心绞痛患者和健康人群血浆miR-29b-3p的表达水平,分析其在两组人群的表达是否存在差异,探讨miR-29b-3p对不稳定型心绞痛的诊断价值。为了进一步研究其功能,采用体外转染技术将miR-29b-3p模拟物(mimics)转染至HepG2细胞系,通过qRT-PCR和Western blot技术分别检测高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)合成调节相关蛋白肝X受体α/β(LXRα/β)、ATP结合转运蛋白A1(ABCA1)在转录水平和蛋白水平的变化,同时检测miR-29b-3p靶蛋白DNA甲基化转移酶3a(Dnmt3a)的变化,从HDL-C代谢调节角度探讨miR-29b-3p对不稳定型心绞痛可能的作用机制。方法:1收集2012年3月-2013年3月就诊于河北省唐山市工人医院心内科符合入组标准的UA患者37例,其中男19例,女18例,平均年龄55±10岁。并选取同一时期在该院体检中心进行体检的年龄性别相匹配的健康人37例作为对照,其中男19例,女18例,平均年龄54±5岁。采集UA组和健康对照组肘静脉血2-3ml(UA组要在进行临床干预前采集),离心,收集血浆,于-80℃低温冰箱保存。2分别提取UA组和健康对照组血浆总RNAs,反转录后采用qRT-PCR技术检测两组miR-29b-3p的血浆水平。3通过细胞培养技术在37℃、5.0%CO2、饱和湿度条件下培养HepG2细胞系,通过体外转染技术将miR-29b-3p mimics转染至HepG2细胞系,该组为转染组(T29);同时设立阴性对照组(Control),该组不转染miR-29b-3p mimics,其它培养条件与实验组相同。4运用Trizol法分别提取T29组和Control组细胞总RNAs。通过qRT-PCR技术检测并比较两组细胞LXRα/β、ABCA1mRNAs的表达水平。5用细胞蛋白裂解液(RIPA)分别提取两组细胞的总蛋白,用Westernblotting技术检测并比较两组细胞Dnmt3a、LXRα/β、ABCA1蛋白的表达水平。6用SPSS13.0软件对实验数据进行统计学分析,数据以均数±标准差或中位数(四分位数)表示,两个组样本间采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1血浆qRT-PCR结果:UA组和健康对照组血浆miR-29b-3p的相对表达量分别为0.000076(0.000026,0.004863)和0.006109(0.003429,0.011532)UA组显著低于健康对照组(Z=-4.33,P<0.001),差异有统计学意义。用ROC曲线分析miR-29b-3p对UA的诊断价值,ROC曲线下面积(AUC)为0.793(P<0.0001)。2细胞实验qRT-PCR结果:T29组ABCA1mRNA表达水平显著高于Control组(P=0.004),差异有统计学意义;T29组和Control组LXRα、LXRβ mRNA的表达水平无显著差异(P值分别为0.956和0.965)。3细胞实验Western blotting结果:T29组Dnmt3a表达水平显著低于Control组(P=0.020),差异有统计学意义;T29组ABCA1的表达水平显著高于Control组(P=0.011),差异有统计学意义;T29组和Control组LXRα、LXRβ蛋白表达水平无显著差异(P值分别为0.813和0.816)。结论:1在UA病理条件下,miR-29b-3p的血浆水平显著下调,提示其参与UA病理过程。2HepG2细胞系转染miR-29b-3p后,Dnmt3a蛋白表达水平下调,证实了miR-29b-3p靶向抑制Dnmt3a。3HepG2细胞系转染miR-29b-3p后,在转录水平和蛋白水平上调ABCA1,而对LXRα/β的mRNA和蛋白水平均无影响,表明miR-29-3p对ABCA1的上调作用没有通过LXRα/β的转录调控。4在HepG2细胞系miR-29b-3p上调ABCA1基因表达,其作用方式与靶向抑制Dnmt3a相关,提示miR-29b-3p介导的ABCA1上调作用与Dnmt3a的甲基化作用密切相关。