研究背景癌症是严重威胁人类健康和生命最主要的疾病之一。现代营养学研究表明,日常膳食与癌症的发生有着密切的关系,约三分之一的癌症发病与饮食有关。饮食结构失衡,过多摄取三高(高脂肪、高蛋白、高糖)一低(低纤维)食物是城乡居民癌症发病率增加的根源之一。研究发现,以豆类蛋白质替代肉类蛋白质的膳食结构能明显降低癌症的发病率。大豆皂甙(Soyasaponin, SS)是从大豆等植物中提取出来的一种生物活性物质,体外细胞培养、动物模型以及人体试验都表明大豆皂甙具有明显的抑癌活性,且大豆皂甙对不同类型癌症的抑制效果因其结构而异。大豆皂醇(Soyasapogenol, SG)是大豆皂甙在肠道中的分解产物,主要有大豆皂醇A、B和E。最近的研究表明,大豆皂醇活性更高。虽然许多研究表明大豆皂甙具有抑癌活性,但对于其抑癌活性的机理却知之甚少。一般而言,致癌作用包括引发阶段、促癌变阶段和进展阶段,其中促癌变阶段具有可逆性,它受环境因素的影响而加快或减慢,为癌症的化学预防提供了最好的可能时机。在促癌变阶段,癌起始细胞与周围正常细胞的细胞间隙连接通讯(GJIC)受到抑制,细胞失去接触抑制进行扩增,基因损伤的恶性表型得以表达,从而形成癌细胞。大量研究资料表明,由细胞间隙连接蛋白(Connexin, Cx)分子构成的GJIC在癌变发生及转移过程中扮演着极为重要的角色。Cx基因在多种肿瘤细胞中表达下降或消失,Cx分子数量也明显降低或消失,GJIC功能发生缺陷或消失,由此导致细胞恶变肿瘤形成。许多促癌剂如佛波酯(TPA)能够下调Cx基因表达,抑制GJIC功能；而许多抑癌活性物质都能上调Cx基因的表达,促进GJIC的功能,从而预防癌症的发生。人参皂甙能通过诱导细胞Cx基因表达,增强细胞GJIC功能,从而抑制肿瘤细胞的生长。目的大豆皂甙预防癌症发生和抑制肿瘤细胞生长的作用和其与人参皂甙在结构上的相似性都预示着其对细胞间隙连接通讯可能具有促进和调节作用。然而到目前为止,国内外关于大豆皂甙对细胞间隙连接通讯功能的作用及其机理还未见报道。因此,本项目以人肝癌细胞HepG2和大鼠正常肝细胞BRL为模型,应用划痕标记荧光染料示踪技术(SLDT)、单细胞凝胶电泳技术(SCGE)、流式细胞术(FCM)、细胞增殖实验(MTT实验)等方法,研究不同结构大豆皂甙对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和细胞间隙连接通讯的影响,以及不同结构大豆皂甙对促癌剂佛波酯抑制正常肝上皮细胞BRL细胞间隙连接通讯的拮抗作用,旨在探讨大豆皂甙抑癌活性的分子机理,为开发大豆皂甙相关抗癌产品以及倡导公众通过合理膳食预防癌症提供科学依据,促进大豆资源的开发利用。方法第一部分：不同结构大豆皂甙对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞间隙连接通讯的影响1大豆皂醇制备参考Gurfinkel等(2005)方法,用甲醇溶解大豆总皂甙后,加入浓硫酸进行热水解,经C-18 Sep-Pak固相萃取柱进行分离制备SG-A和SG-B,纯度分别为57.3%和62.6%。2细胞增殖抑制实验(MTT实验)人肝癌HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于25cm2培养瓶中进行培养和传代,将处于对数生长期的细胞以1×104／mL密度接种于96孔细胞培养板,每孔200μL,在37℃、5%CO29孵箱中培养24h细胞贴壁后,加入不同浓度(10,20,40,80,100,160,200,400μg／mL)的大豆皂甙(SG-A,SG-B和TS),同时设不加药物的阴性对照和不接种细胞的空白对照。每个浓度每个时间点设置6个重复孔。继续培养24、48和72h,在每个时间点结束时于每孔培养板中加入20μL MTT,孵育4h后小心吸去上清,每孔加入200μL DMSO,于酶标仪上测定570nm吸光值(A),实验重复3次。细胞增殖抑制率按下式计算：抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100。3细胞增殖半数抑制浓度(IC50)检测在MTT法中,以对照组吸光度值OD值减少一半所需的药物浓度为IC50。本次研究采用的是SPSS软件Probit概率单位模型来计算。4细胞凋亡检测收集阴性对照组和400μg/mL大豆皂甙(SG-A,SG-B和TS)分别作用24、48、72h后的细胞,按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明于流式细胞仪上进行细胞凋亡分析。5划痕标记荧光染料示踪技术试验(SLDT)(1)将人肝癌HepG2细胞接种于30mm培养皿中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24h贴壁后进行处理,分别为1个正常对照组(DMEM培养基)和3个药物组(100μg/mL TS,100μg/mL SG-A和100μg/mL SG-B),每个处理平行设置三个细胞培养皿,继续孵育90 min；(2)小心吸去细胞培养液,用PBS缓冲液冲洗3遍；(3)在30mm培养皿细胞中,用手术刀片压3条切痕；(4)向每个培养皿中分别加入1mL LY(荧光黄,1mg/mL),孵育3 min,吸去荧光黄LY；(5)再用PBS缓冲液冲洗2遍；(6)加入4%的甲醛溶液固定4 min,移去甲醛；(7)在荧光显微镜下,观察,拍照,用Photoshop软件的标尺功能测量迁移距离。6统计分析用SPSS13.0软件对细胞增殖抑制数据和细胞凋亡率数据进行析因设计资料的方差分析和单因素方差分析,结果以x±s形式,P<0.05表示统计差异显著。用SPSS13.0的Probit程序计算细胞增殖半数抑制浓度(IC50)。第二部分：不同结构大豆皂甙对大鼠正常肝细胞间隙连接通讯的影响1大豆皂甙对大鼠正常肝细胞BRL生长的影响大鼠正常肝细胞BRL用含10%胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基于25cm2培养瓶中进行培养和传代。将处于对数生长期的细胞按1×104／mL密度接种于96孔细胞培养板,每孔200μL,在37℃、5%CO2孵箱中培养24h细胞贴壁后,加入不同浓度(50-2000μg／mL)的大豆皂甙(SG-A,SG-B和TS),同时设不加药物的阴性对照和不接种细胞的空白对照。继续培养24、48和72h,每个浓度每个时间点设置6个重复孔。在每个时间点结束时于每孔培养板中加入20μL MTT,孵育4h后小心吸去上清,每孔加入200μL DMSO,于酶标仪(美国BioTek Elx808)上测定570nm吸光值(A),实验重复3次。细胞增殖抑制率按下式计算：抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100。2划痕标记荧光染料示踪技术试验(SLDT)方法(1)将大鼠肝正常上皮细胞BRL细胞接种于30mm细胞培养皿中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24h贴壁后进行药物处理；(2)药物处理方法：A.共孵育90 min：取在30mm细胞培养皿中生长贴壁的大鼠肝正常上皮细胞BRL,将促癌剂佛波酯(TPA)与不同形式大豆皂甙(TS,SG-A和SG-B)与大鼠正常肝细胞BRL共同孵育90 min。共分为11个处理组,其中1个正常对照组(加DMEM)、1个阳性对照组(加50ng/mL佛波酯TPA)、9个药物处理组,即50ng/mL TPA加100μg/mL TS、50ng/mL TPA加200μg/mL TS、50ng/mLTPA加400μg/mL TS;50ng/mL TPA加100μg/mL SG-A、50ng/mL TPA加200μg/mL SG-A、50ng/mL TPA加400μg/mL SG-A;50ng/mL TPA加100μg/mL SG-B、50ng/mL TPA加200μg/mL SG-B、50ng/mL TPA加400μg/mL SG-B。每个处理设置3个细胞培养皿,实验重复3次。B.预孵育24h：取在30mm细胞培养皿中生长贴壁的大鼠肝正常上皮细胞BRL,分别加入不同形式(TS、SG-A、SG-B)不同浓度(100、200、400μg/mL)的大豆皂甙预处理24h,处理组别设置同上,在结束前90 min,加入将促癌剂佛波酯(TPA),继续孵育90 min。(3)将药物处理好的细胞用PBS缓冲液冲洗3遍；(4)在30mm培养皿细胞中,用手术刀压3条切痕；(5)在每个培养皿中,分别加入1mL LY(荧光黄,1mg／mL),孵育3 min,吸去LY；(6)用PBS缓冲液冲洗2遍；(7)加入4%的甲醛溶液固定4 min,移去甲醛；(8)在荧光显微镜下,观察,拍照,用Photoshop软件的标尺功能测量荧光染料迁移距离。3单细胞凝胶电泳试验方法(1)将传代的大鼠肝正常上皮细胞BRL接种于24孔细胞培养板,于37℃、5%CO2孵箱中培养24h细胞贴壁后,进行6种处理：1个阴性对照组(加等量的DMEM培养基),一个溶剂对照组(加等量的0.5%乙醇),1个阳性对照组(加50ng/mL TPA);和3个TPA与大豆皂甙共处理组(50ng/mL TPA+100μg/mL TS、50ng/mL TPA+200μg/mL TS、50ng/mL TPA+400μg/mL TS)。每个处理组设置4个细胞培养孔重复,实验重复3次。实验处理结束后胰蛋白酶消化,离心收集细胞；(2)将配制好的0.5%的LMP放入37℃水浴锅中；(3)用20μL PBS重悬细胞,与80μL0.5%低溶点琼脂糖混合铺胶；(4)待胶凝固,将凝胶置于细胞裂解液中1.5h(4℃避光)；(5)电泳前玻片置电泳液静置20 min液面高于玻片2 mm,使DNA解旋；(6)电泳,电泳时调节液面高度,使电流为300 mA、电压25 V,时间20min；(7)中和,电泳完毕将凝胶置于中和液内,每次5 min,共3次,晾干；(8)染色,观察前在凝胶上滴加1μg/mL EB染色5 min；(9)观察,在荧光显微镜下(515 nm激发波长)观察结果,每种细胞随机计数100个细胞,记录彗星细胞数。彗星细胞率=(彗星细胞数／观察细胞总数)×100%；(10)3-8步骤均在暗光下进行,以免细胞DNA受到额外损伤。3统计分析用SPSS13.0软件对SLDT测量LY迁移距离所得数据进行单因素方差分析,结果以x±s形式,P<0.05表示统计差异显著。用SPSS13.0软件对单细胞凝胶电泳的数据进行整体x2检验,即R×C表资料的x2检验,再进行多个样本率间的多重比较,P<0.05表示统计差异显著。结果第一部分：不同结构大豆皂甙对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞间隙连接通讯的影响1大豆皂甙对HepG2细胞增殖的影响如表1-1所示,不同结构大豆皂甙对HepG2细胞增殖抑制率呈现时间和浓度依赖性,随时间的延长,抑制细胞增殖的效果更加显著(F=2085.956,P<0.001)；随着大豆皂甙浓度的增加,细胞增殖抑制率显著升高(F=2117.180,P<0.001)(图1-1,图1-2)。SG-B和SG-A对细胞增殖的抑制效果较TS显著(F=687.155,P<0.001)。2细胞增殖半数抑制浓度不同结构大豆皂甙作用HepG2细胞72h后的半数抑制浓度有明显差异(图1-3),SG-A和SG-B的ICso值低于TS(P<0.05)。3大豆皂甙(浓度为400μg/mL)对HepG2细胞凋亡的影响大豆皂甙作用HepG2细胞后能检测到明显的细胞凋亡现象(表1-3)。处理24h后,SG-A、SG-B和TS诱导的早期凋亡均显著高于对照组(P<0.05),三种不同结构大豆皂甙诱导早期凋亡的作用呈现差异(SG-B>SG-A>TS)。随着作用时间的延长,以晚期凋亡为主。4大豆皂甙对人肝癌细胞HepG2细胞间隙连接通讯的影响从图1-8中可以看出,HepG2细胞的细胞间隙连接通讯功能非常弱,与文献报道一致,加入浓度为100μg/mL不同结构大豆皂甙并不能增强人肝癌HepG2细胞的细胞间隙连接通讯功能。第二部分：不同结构大豆皂甙对大鼠正常肝细胞间隙连接通讯的影响1不同结构大豆皂甙对BRL细胞增殖的影响如图2-1所示,不同结构大豆皂甙(SG-A,SG-B,TS)在不同浓度时,对BRL细胞增殖的影响结果,在浓度为1000-2000μ/mL时,SG-A和SG-B组BRL细胞增殖率显著下降,TS组BRL细胞增值率也有下降,故木部分实验将大豆皂甙浓度设定为100-400μg/mL。2 SLDT法检测不同结构大豆皂甙对TPA抑制BRL细胞间隙连接通讯功能的影响运用两种不同的药物处理方式即：将BRL细胞与TPA和不同形式的大豆皂甙同孵育90 min和将大豆皂甙与BRL细胞预孵育24h,结果均显示正常大鼠肝细胞BRL有非常强的GJIC功能,促癌剂佛波酯(10ng/mL)能完全抑制其GJIC功能,而不同形式大豆皂甙均能恢复BRL细胞间隙连接通讯功能。进一步研究显示,预孵育24h的处理方式,可能对BRL细胞间隙连接通讯的恢复作用更加明显。2 SCGE法检测不同浓度的大豆总皂甙对BRL细胞间隙连接通讯功能的影响单细胞凝胶电泳实验结果经x2检验,与对照组相比,除TPA50+400组无显著性差别外,其余各染毒组拖尾率均显著高于对照组(P<0.05)。与溶剂组相比,除TPA+400组无显著性差别外,其余各染毒组拖尾率均明显高于溶剂组(P<0.05)。本次试验能观察到不同浓度的TS对TPA抑制BRL细胞GJIC功能有增强作用。结论1.大豆皂醇A,大豆皂醇B和大豆总皂甙均表现出对人肝癌HepG2细胞的增殖的抑制作用,并呈浓度和时间依赖关系。大豆皂醇SG-A和SG-B抑制HepG2细胞的活性强于大豆总皂甙TS。2.三种形式的大豆皂甙均能诱导HepG2细胞发生凋亡,作用24h后主要发生早期凋亡,诱导细胞早期凋亡的活性大小为：SG-B>SG-A>TS。3.人肝癌HepG2细胞的间隙连接通讯功能较弱,木次试验用浓度为100μg/mL的大豆皂甙未能观察到其对HepG2细胞间隙连接通讯功能的增强作用。4.正常大鼠肝细胞BRL有非常强的GJIC功能,10ng/mL的促癌剂佛波酯能完全抑制其细胞间隙连接通讯功能。三种结构的大豆皂甙均能拮抗佛波酯对BRL细胞的细胞间隙连接通讯的抑制作用。