研究背景糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是严重危害人类健康的全身性代谢疾病,是当前全球面对的重大健康问题。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见的微血管并发症,是2型糖尿病患者的重要死亡原因,也是导致终末期肾功能衰竭(End-stage renal disease, ESRD)的主要病因。DN的发病机制十分复杂,涉及到血流动力学异常、炎症介质释放、氧化应激及细胞凋亡等多因素的作用,但具体机制尚不完全清楚。肾小球的滤过屏障由毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜(Glomerular basement memberane, GBM)以及足细胞组成。肾小球足细胞是一种终末分化的细胞,它附着在GBM外侧,是肾小球滤过膜的重要组成部分,在维持肾小球滤过屏障的结构和功能中发挥重要作用。既往大量研究表明足细胞在蛋白尿相关性肾脏疾病的发生发展中发挥关键作用,是研究糖尿病蛋白尿发生与进展的中心靶细胞,因此,阐明DN足细胞损伤的分子机制具有重要意义。近年来大量研究显示高血糖导致的“代谢记忆”可持续增加包括DN等并发症发生的危险,这提示除了基因因素外表观遗传学机制很可能参与DN的发生。表观遗传学是一门新型遗传学分支学科,是指在不涉及基因突变或DNA碱基改变情况下对基因表达进行调控并稳定遗传。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰,其中DNA甲基化是与基因转录活性密切相关的一种重要的表观修饰。DNA甲基化是在甲基化转移酶(Dnmt)的作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基(团),将甲基(团)转移到DNA分子的脱氧胞苷(cytosine,C)的嘧啶环第5号碳原子上,使其转变成甲基化脱氧胞苷(dmC)。哺乳动物基因组内大部分dmC后紧跟着一个鸟嘌呤(guanine,G)形成dmCpG。既往研究表明,DNA甲基化高低与基因的表达呈反比关系,甲基化程度高,基因的表达则降低,相反,去甲基化即低甲基化又可使基因的表达增加。DNA甲基化参与了机体的许多生物学过程,如基因转录调控、基因组印迹、W染色体失活、细胞分化和发育等。此外,DNA甲基化也是可逆的,抑制Dnmt活性可导致基因组甲基化水平降低,进而促进基因转录。从DNA甲基化角度探讨肾脏疾病的发病机制已成为肾脏病领域的一个研究新热点。Ingrosso D等研究发现终末期肾衰竭患者外周血存在明显DNA低甲基化,且DNA甲基化状态与同型半胱氨酸水平相关,高同型半胱氨酸血症可能通过DNA甲基化影响基因表达,这提示高半胱氨酸的毒性作用可能通过大分子物质低甲基化介导。最近Bechtel W等也对肾脏纤维化进行了DNA甲基化研究。研究发现RASAL1基因(其编码产物抑制Ras癌蛋白)高甲基化与肾脏成纤维化细胞持续活化及纤维化形成相关。在肾脏纤维化形成中,DNA甲基转移酶(Dnmt1)介导了RASAL1高甲基化。在Dnmt1+/-杂合子小鼠中肾脏纤维化程度减轻。该项研究结果表明：DNA甲基化是成纤维化细胞持续活化及纤维化形成的分子机制。最近也在DN近端肾小管细胞、肾小球系膜细胞及外周血细胞发现存在DNA甲基化异常。从DNA甲基化角度探讨DN发病机制为该类疾病的病因提供了新的思路,为DN的预防和治疗带来了新的契机。基于以上,为此课题以2型DN肾小球足细胞为研究对象,首次从表观遗传学角度解析DNA甲基化在其足细胞损伤中的作用及机制,通过体内外实验明确DNA甲基化在2型DN足细胞损伤中的作用及可能分子机制。本研究结果不仅有助于加深对2型DN肾小球足细胞损伤机制的理解,而且很可能为发展新的治疗策略提供重要的线索,为开发新型足细胞靶向治疗生物制剂积累资料,并为开展蛋白尿相关肾脏疾病的研究注入新的动力和新的方向,从而为治疗这些疾病提供更为有效的方法。研究方法一、DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)对2型糖尿病肾病db/db小鼠的治疗作用。动物实验分组：18只12周龄C57BLKS/J db/db小鼠及12只同一遗传背景野生型BKS小鼠,分别检测小鼠体重、饮食、饮水、血糖、尿白蛋白／肌酐比值,判断小鼠模型的成模情况。采用完全随机的方法,随机分为5组：BKS小鼠组(6只)；BK5’+5-Aza(2mg/kg wt,3次／周)组(6只)；db/db小鼠组(6只); db/db+5-Aza (1mg/kg wt)干预组(6只)；db/db+5-Aza (2mg/kg wt)干预组(6只)。采用上述剂量每周3次腹腔注射给药,观察治疗8周。实验期间每1周测空腹血糖、体重、饮食、饮水,每2周收集24小时尿液,采用ELISA法检测尿白蛋白／肌酐比值。实验结束时,采用10%水合氯醛(0.25ml/50g)腹腔注射麻醉小鼠,从眼眶后静脉丛获得血液样本,测定血尿素氮,血肌酐,血脂,并称心脏,肝脏和肾脏组织重量。留取肾脏组织行PAS染色,免疫组织化学检测WT1并计数足细胞数目。电镜观察肾小球足细胞损伤情况。Western blot检测足细胞裂孔膜相关蛋白nephrin和podocin蛋白表达。二、自发性2型糖尿病db/db小鼠肾组织DNA甲基化转移酶(Dnmts)及核蛋白Sp1及NF-κB p65的表达。荧光定量PCR检测肾组织Dnmt1、Dnmt3a及Dnmt3b mRNA相对表达；对小鼠肾组织进行冰冻切片,并于-80℃冰箱保存,应用免疫荧光法借助激光共聚焦显微镜观察肾小球足细胞Dnmt1、Sp1及NF-κB p65蛋白的表达。Western blot检测肾组织Dnmt1蛋白表达。三、小鼠足细胞培养、鉴定及予不同处理并分组(1)足细胞培养：小鼠条件永生化足细胞由拉什大学医学中心Jochen Reiser教授惠赠。用Ⅰ型胶原包被培养瓶,在33℃,5%CO2培养箱环境下,用含25-100U·mL-1干扰素(IFN-γ)的RPMI 1640培养基(培养基含10%FBS)培养,以其获得增殖能力。随后以一定细胞密度传代于不含IFN-γ的DMEM培养基(5% FBS)中,并放置在37℃,5% CO2培养箱中培养,经10-14天后,足细胞进入分化阶段并最终分化成熟。(2)足细胞形态学观察及鉴定：在显微镜下分别对两种不同条件下培养的足细胞(33℃含IFN-γ培养及2-4天和37℃不含IFN-γ培养10-14天)拍片,观察两种状态下足细胞的形态学差异。应用免疫荧光法观察特异足细胞骨架蛋白synaptopodin表达情况。表达该蛋白的细胞为分化成熟足细胞,不表达的则为未分化的足细胞。(3)足细胞的不同处理并实验分组：1)con组：5.3mM Glu DMEM培养基分别培养足细胞24、48及72小时；2)HG组：30mM Glu DMEM培养基分别培养足细胞24、48及72小时；3)HG+5-Aza组：30mM Glu+10μM 5-Aza干预48小时；4) HG+Dnmt1-siRNA组：30mM Glu+50nM Dnmtl-siRNA干预48小时；5) HG+Sp1-siRNA组：30mM Glu+50nM Spl-siRNA干预48小时；6) HG+p65-siRNA组：30mM Glu+50nM p65-siRNA干预48小时；7) HG+Con-siRNA组：30mM Glu+50nM non targeting-siRNA干预48小时；8) HG+M1组：30mM Glu干预48小时+0.1μM MithramycinA干预24小时；9) HG+M2组：30mM Glu干预48小时+0.5μM MithramycinA干预24小时；10)HG+M3组：30mM Glu干预48小时+1μM MithramycinA干预24小时；11)HG+B1组：30mM Glu干预48小时+0.5gM BAY 11-7082干预24小时；12)HG+B2组：30mM Glu干预48小时+1μMBAY 11-7082干预24小时；13)HG+B3组：30mM Glu干预48小时+2μM BAY 11-7082干预24小时；四、经过不同处理分化成熟足细胞其甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b表达和Sp1、NF-κB p65及足细胞裂孔膜相关蛋白nephrin、podocin表达。荧光定量PCR分别检测不同处理分化成熟足细胞Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Spl、NF-κB p65 mRNA表达。免疫荧光和或蛋白印迹检测Dnmt1、Sp1、 NF-κBp65及足细胞裂孔膜相关蛋白nephrin、podocin表达。五、足细胞活动力检测。迁移板法(Transwell migration assay):在Ⅰ型胶原包被的Transwell板上腔室中种植1×104数目分化成熟足细胞,在下腔室中装入给予不同处理因素的培养基培养48小时。4%多聚甲醛固定30min,用棉签拭去Transwell上层小室内未迁移的细胞,0.1%结晶紫染色30分钟,采用用倒置相差显微镜拍照并计数迁移细胞的数目。六、足细胞单层滤过屏障功能评估。白蛋白流量率检测(Albumin Influx Assay):足细胞(5×103)接种到鼠尾Ⅰ型胶原蛋白包被的Transwell板(3μm微孔,康宁,纽约)的上腔室,并在分化条件下培养。10天后,分化足细胞进行血清饥饿过夜。在含30mM葡萄糖的DMEM培养基中加入含或不含DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(10μM)干预足细胞48小时。Dnmtl-siRNA(50nM)预处理足细胞6小时,然后予30mM的葡萄糖继续干预48小时。用含1mM的氯化镁和1mM氯化钙的PBS溶液洗涤细胞两次。在上腔室加入150μLRPMI1640,在下腔室加入1ml含40mg/ml牛血清白蛋白的RPMI1640培养基,并在37℃下培养6小时,采用蛋白检测试剂盒检测上清液蛋白浓度。七、核蛋白Spl和NF-κB p65免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation,Co-IP)采用上海生工的细胞核蛋白质提取试剂盒抽提核蛋白Spl和NF-κB p65。按照南京凯基BCA蛋白浓度检测试剂盒定量蛋白浓度。采用Pierce Co-Immunoprecipitation试剂盒(26149,Pierce; Rockford, IL)说明书进行核蛋白Spl和NF-κB p65免疫共沉淀实验。八、染色质免疫共沉淀-荧光定量PCR根据Millipore公司的EZ　ChIP试剂盒(Upstate Biotechnology Inc., Waltham,MA)说明书进行此实验。即1%甲醛(最终浓度)处理细胞以使蛋白质和DNA交联,染色质由高频超声打断成500-800bp的DNA片段。4℃,12000g离心5分钟后取上清,加入Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA孵育过夜以去除非特异性结合。4℃,12000g离心1分钟取上清,加入抗Spl(Santa Cruz)抗体或非免疫IgG抗体(Upstate Biotechnology Inc.),4℃.孵化过夜。随后加入Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA4℃缓慢转动60分钟,以沉淀Spl抗体识别的蛋白或相应的复合物,随后依次洗涤、洗脱,交联逆转和纯化。纯化的DNA样品进行扩增,针对目的基因Dnmtl启动子序列(-119-+102bp)设计引物,采用TAKARA公司SYBR Green qPCR SuperMix在Agilent Stratagene MX3000P定量PCR仪上定量分析。九、统计学处理计量资料数据以均数±标准误(x±SEM)表示,应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,两组间差异比较采用两独立样本t检验；其它多组间结果的比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齐性用Bonferonni’s法或Turkey法进行组间多重比较,方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。检验的显著性水准为α=0.05,P<0.05被定义为有统计学差异。结果1.与正常BKS小鼠比较,12周龄时,db/db小鼠表现明显的多饮、多食、多尿、体型肥胖；空腹血糖及尿蛋白肌酐比值明显增高(P值均<0.001),说明自发性2型DN小鼠模型是成功的。2.DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷(5-Azacytidine)明显减少白蛋白尿,降低血肌酐,降低甘油三脂(TRIG)、总胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL),并抑制系膜基质增生及基底膜增厚,减轻足突融合,增加足细胞数目及足细胞裂孔膜相关蛋白nephrin、podocin表达,然而代谢指标如体重,饮食、饮水和空腹血糖未发生明显改变。3.在体外高糖处理的分化成熟足细胞,DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)上调足细胞裂孔膜相关蛋白nephrin、podocin蛋白表达。抑制足细胞活动力增加,降低足细胞白蛋白流量率,改善足细胞滤过屏障功能。4.自发性2型糖尿病db/db小鼠肾小球足细胞及体外高糖处理的足细胞Dnmt1、Spl及NF-κBp65表达增加。2型DN患者肾小球足细胞Dnmtl表达明显增加。DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷、Spl抑制剂MithramycinA及NF-κB p65抑制剂BAY 11-7082可抑制高糖导致足细胞Dnmt1高表达。5.免疫共沉淀显示Spl及NF-κBp65在核内结合。染色质免疫共沉淀显示Spl结合到Dnmtl启动子区域(-119-+102bp)。Spl抑制剂IMithramycinA及特异Spl敲低均可降低高糖导致的足细胞Dnmt1高表达。结论1、体内研究表明DNA甲基化抑制剂明显降低白蛋白尿,改善肾功能,减轻足细胞损伤,延缓2型DN进展。2、体外研究表明DNA甲基化抑制剂上调足细胞裂孔膜相关蛋白nephrin、 podocin蛋白表达。抑制足细胞活动力增加,降低足细胞白蛋白流量率,改善足细胞滤过屏障功能。3、2型DN足细胞损伤中存在DNA甲基化异常。DNA甲基化抑制剂也许是治疗DN和保护足细胞的一种新策略,Spl/NF-κB p65-Dnmt1信号路径可能是DN足细胞损伤的干预新靶点。