目的：气道上皮细胞是呼吸系统与外界接触的第一道天然屏障,越来越多的研究表明气道上皮细胞可以通过自身的机械性屏障功能、分泌功能、代谢功能与抗原呈递功能等过程参与对呼吸系统的应激反应及内环境稳态的调节。因此,气道上皮的结构与功能稳态是呼吸系统维持正常换气功能和防御功能的细胞基础。气道上皮细胞是一层排列紧密的假复层上皮细胞,通过细胞与细胞之间以及细胞与基底膜之间的粘附气道上皮细胞整齐排列并粘附在基底膜上。气道上皮的结构性整合粘附依赖于气道上皮表达的粘附分子家族。Integrinβ4是气道上皮细胞表达的一类结构性粘附分子蛋白,通过半桥粒结构介导气道上皮细胞与基底膜的粘附及整合。与整合素其它家族成员不同,integrinβ4胞内含有一段特殊的结构性功能域,提示其可能参与气道上皮细胞的一系列信号通路,进而与气道上皮的应激反应、功能稳态密切相关。但是,除了粘附功能以外,integrinβ4在气道上皮的表达及功能属性的相关研究很少。本实验室在先前的研究中应用基因芯片及生物信息学方法筛选了哮喘病人外周血白细胞差异表达的粘附分子,发现integrinβ4基因在哮喘病人中表达明显下调,提示integrinβ4表达改变可能与哮喘等呼吸系统疾病的发病密切相关,但具体的内在机制仍不清楚。因此,本课题研究主要包括以下几个部分：(1) Integrinβ4在气道上皮细胞氧化应激、损伤修复中的作用：(2) Integrinβ4在哮喘病人气道黏膜的表达及与哮喘发病的相关性；(3) Integrinβ4与臭氧应激后AHR发病的相关性；(4) Integrinβ4对气道上皮细胞抗原呈递及淋巴细胞分化的调节。方法与结果：1) Integrinβ4在气道上皮细胞氧化应激及损伤修复中的作用体外培养的人支气管上皮细胞株(16HBE14o-)及原代大鼠气道上皮细胞(RTE),分别用臭氧攻击30 min,免疫组化及流式检测显示,臭氧应激后,integrinβ4在16HBE14o-及RTE细胞上的表达明显上调。建立OVA应激的大鼠哮喘模型,抗氧化能力检测显示活性氧自由基在OVA应激后的大鼠气道上皮细胞中含量明显增加,免疫组化及real time RT-PCR结果显示integrinβ4在OVA模型大鼠的气道上皮表达下调,以上结果提示integrinβ4可能参与了气道上皮细胞的氧化应激过程。另外,我们观察了integrinβ4在机械损伤后的气道上皮细胞的表达,在生长融合的16HBE14o-及RTE细胞培养板上机械刮擦形成一个损伤区域,12h后免疫细胞化学观察发现在机械损伤边缘的气道上皮细胞呈现迁移趋势,integrinβ4在损伤边缘的上皮细胞表达显著上调,提示integrinβ4可能参与了气道上皮的损伤修复过程。为阐明integrinβ4在气道上皮细胞损伤修复及氧化应激过程中的作用,我们利用integrinβ4高表达载体和integrinβ4沉默载体建立integrinβ4在RTE细胞中的高表达和沉默细胞系,籍此观察integrinβ4在气道上皮细胞氧化应激及损伤修复中的作用。损伤修复能力用损伤修复指数测定,增殖由MTT法测定。抗氧化能力及三种抗氧化酶的表达通过相应的试剂盒检测。结果显示integrinβ4表达上调可明显促进RTE的损伤修复能力,其调节能力可能与上皮细胞的增殖能力相关。另外,integrinβ4的表达水平与RTE的抗氧化能力密切相关,其表达上调可增进RTE的总抗氧化能力,进一步结果提示integrinβ4对RTE抗氧化能力的调节与GSH-Px, SOD, catalase三种抗氧化酶的表达水平相关。以上结果提示integrinβ4作为经典的结构性粘附分子在气道上皮细胞组成性表达,其表达受各种刺激因素敏感调节。除结构性粘附功能外,integrinβ4还参与到对气道上皮细胞的损伤修复、抗氧化能力等过程的调节。在OVA应激后的哮喘模型中,气道上皮细胞integrinβ4表达明显下调,进而诱导气道上皮细胞损伤修复过程减慢,抗氧化能力降低,与OVA应激后的哮喘表型紧密相关。因此,我们推断integrinβ4可能与哮喘、变应性鼻炎等气道上皮性疾病的发病相关。2) Integrinβ4在哮喘病人气道黏膜的表达及其与哮喘发病的相关性本实验室在先前的研究中应用基因芯片及生物信息学方法筛选了哮喘病人外周血差异表达的粘附分子,结果发现integrinβ4基因在所有哮喘病人中表达均下调。Integrinβ4是一类经典的结构性粘附分子,它在气道上皮细胞组成性表达维持气道上皮的结构及功能完整。哮喘病人气道上皮表现为明显的结构损伤及上皮脱落,提示可能存在粘附分子成员的表达缺陷。因此我们推测integrinβ4在哮喘病人的气道黏膜可能存在差异表达并与哮喘发病相关。为探讨integrinβ4在支气管肺组织的分布表达及其与哮喘发病的相关性,这一部分工作我们观察了integrinβ4在正常人及哮喘病人的气道粘膜的表达。免疫组化结果显示,在正常人的气道黏膜,上皮结构完整,上皮细胞排列整齐,integrinβ4组成性高表达。在哮喘病人的气道黏膜,上皮细胞出现结构损伤,上皮细胞松动脱落明显,integrinβ4的膜内及膜外蛋白表达明显下调。为进一步研究哮喘病人气道黏膜integrinβ4表达下调与哮喘发病的相关性。我们设计并筛选integrinβ4特异性siRNA (small interference)序列,进一步构建包装为慢病毒载体,在16HBE14o-沉默integrinβ4基因后,观察16HBE14o-在integrinβ4表达下调后粘附能力、损伤修复过程、细胞周期及细胞凋亡的变化。结果显示integrinβ4沉默后,16HBE14o-粘附率明显减低,细胞增殖周期被抑制,大量细胞停留在G1期,S期细胞明显减少,G2/G1减小,损伤修复速度减慢,细胞凋亡明显增加。以上结果提示integrinβ4在哮喘病人气道上皮细胞表达明显下调,进而诱发了气道上皮细胞的粘附率降低,G1期阻止,损伤修复速度减慢,细胞活力降低,凋亡率增加,与哮喘病人气道上皮细胞病理改变的临床表型及发病机制密切相关。3) Integrinβ4与臭氧应激诱导的AHR (airway hyperresponsiveness,气道)发病的相关性AHR是哮喘,变应性鼻炎等呼吸系统疾病的主要临床表现之一。大量的动物实验及离体实验研究发现AHR的发病与气道上皮细胞的结构完整及功能稳态相关。本研究第二部分结果显示,integrinβ4在哮喘病人的气道黏膜表达特异性下调,诱导气道上皮的增殖抑制,损伤修复减慢,与哮喘病人气道上皮细胞的病理改变密切相关。我们推测integrinβ4缺陷表达诱导的上皮细胞功能失稳态可能与AHR的诱发有关。为研究integrinβ4表达与AHR之间可能存在的内在联系,我们建立了臭氧攻击不同时间诱导的AHR动物模型。在臭氧攻击不同时间点,分别检测臭氧攻击诱导的的气道反应性和integrinβ4的表达水平。RL (lung resisitence)由Buxco小动物呼吸功能测量系统检测,结果提示,臭氧攻击后可诱发明显的AHR, AHR程度伴随臭氧攻击时间的增长而更加明显。臭氧攻击结束后,AHR改变逐渐减弱回复正常。免疫组化及real time RT-PCR定量检测integrinβ4表达水平,结果显示臭氧攻击后,integrinβ4蛋白及mRNA表达水平伴随臭氧攻击而逐渐下调,臭氧攻击结束后,integrinβ4表达逐渐上升恢复。相关性分析结果显示臭氧攻击AHR模型中,组胺激发后的RL水平与integrinβ4表达水平呈明显负相关,提示臭氧攻击后AHR的诱发可能与integrinβ4表达密切相关。体外沉默integrinβ4在16HBE14o-的表达,结果发现integrinβ4下调后16HBE14o-抗细胞氧化能力减弱,细胞凋亡明显增加。以上结果提示,臭氧攻击大鼠后诱发明显AHR病变。Integrinβ4在臭氧攻击后的大鼠气道上皮表达明显下调,进而诱导气道上皮细胞抗氧化能力减弱,细胞凋亡增加,可能与臭氧攻击后AHR发病相关。4) Integrinβ4对气道上皮细胞抗原呈递及淋巴细胞分化的调控气道上皮在抗原应激后可识别抗原并进行抗原呈递,进而诱导气道局部的淋巴细胞增殖分化,故气道上皮细胞的抗原呈递过程与气道局部的免疫炎症反应紧密相关。哮喘病人气道黏膜局部表现为典型的Th2型淋巴细胞炎症反应,本研究第二部分结果显示,integrinβ4在哮喘病人气道上皮表达下调,且与哮喘病人气道上皮细胞的结构功能失稳态密切相关。我们推测哮喘病人气道上皮细胞integrinβ4表达下调可能参与对气道上皮细胞抗原呈递过程的调节,进而与哮喘病人气道局部T淋巴细胞分化及Th2型炎症表型相关。为验证以上假设,本研究观察了integrinβ4下调对气道上皮细胞的抗原呈递能力及T淋巴细胞的增殖及分化的影响。免疫荧光实时定量观察结果显示integrinβ4沉默后气道上皮细胞对外界抗原的识别及摄取能力明显减慢；对照上皮细胞和integrinβ4沉默上皮细胞分别与T淋巴细胞共培养,用CFSE-DA标记T淋巴细胞检测淋巴细胞增殖,ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)检测共培养后细胞上清液中的细胞因子含量。结果显示：与正常上皮细胞+淋巴细胞共培养体系相比,与integrinβ4沉默气道上皮细胞+T淋巴细胞共培养体系中T淋巴细胞活化增殖能力降低,共培养体系上清液中Thl型细胞因子IFN-gamma减少,Th1/Th2比值降低。以上结果提示integrinβ4在哮喘病人气道黏膜的表达下调诱导气道上皮细胞抗原呈递能力减弱,并抑制气道黏膜局部T淋巴细胞Thl性增殖分化,与哮喘病人气道黏膜局部的Th2型炎症反应密切相关。结论：Integrinβ4在气道上皮细胞组成性表达,其表达受各种外界刺激敏感调节。除结构性粘附功能外,integrinβ4参与对气道上皮细胞损伤修复、抗氧化等生理功能稳态的维持与调节。Integrinβ4在哮喘病人气道上皮及哮喘模型动物气道上皮表达下调,导致上皮结构性损伤及功能失稳态,诱导AHR,调控气道局部的淋巴细胞向Th2型炎症反应增殖分化,与哮喘的临床表型及发病机制密切相关。