南极陆地生态系统是寒冷、干燥和低营养环境,并伴随着急剧的温度变化和极少的可利用水资源。由于严酷的气候条件,植物主要生长在南极大陆海岸线边缘无冰雪覆盖的陆地表层,通常是一小块孤立的地方。隐花植物(苔藓和地衣)是南极大陆最主要的植物类型,这些南极植物为发现新的功能基因和揭示极端环境适应机制以及生物进化提供了良好的材料。但是,到目前为止,对于南极苔藓适应极端环境条件的生存机制仍然不清楚。本研究中,我们利用Illumina公司的高通量测序技术分析了南极丝瓜藓(Pohlia nutc ms)在低温、高盐胁迫下的转录组,从基因组水平上分析了一些重要抗逆基因的表达特征。此外,我们分析了类黄酮羟化酶和JAZ蛋白在南极丝瓜藓(Pohlia nutans)适应极端环境中的作用。本研究对于揭示南极苔藓适应极端环境机理,促进极地特殊基因资源的开发和利用具有一定的理论意义和应用价值。1、利用第二代转录组测序技术分析南极丝瓜藓的抗逆相关功能基因从基因组水平上研究南极丝瓜藓(Pohlia nutans)的功能基因在寒冷胁迫条件下的响应特征,对于发掘抗逆相关基因及其在适应极地极端环境中的作用十分重要。本研究在国内外率先利用第二代高通量测序技术分析了南极丝瓜藓(Pohlia nutans)在正常条件下、低温胁迫(4℃,6h)下和高盐胁迫下(200mM NaCl,1h)的基因表达谱特征。转录组测序产生的数据已经提交国际Short Read Archive(SRA)数据库,公开注册号为SRA051595；转录组测序拼接之后的数据提交到DDBJ/EMBL/GenBank数据库,公开注册号为GACA00000000。转录组测序后最终共得到93488的单一基因序列,平均长度为405个碱基；单一基因序列大于500个碱基的共有18688个。基因功能注释发现有16782个序列编码已知功能蛋白；它们中多数都可以通过GO、KOG和KEGG数据库进行聚类分析和代谢通路分析。基因组水平上的基因差异表达分析表明,在寒冷胁迫条件下有3796个转录本的表达水平显著上调,有1405个转录本的表达水平显著下调。在盐胁迫条件下有820个转录本的表达水平显著上调,有350个转录本的表达水平显著下调。并且,我们从南极丝瓜藓转录组中共鉴定得到了816类受体蛋白激酶(receptor-like kinases)基因和1309转录因子。对转录组的基因差异表达分析发现类受体蛋白激酶、转录因子和次生代谢关键酶等可能在南极苔藓抗逆机制中发挥重要作用。本文从基因组水平上分析了一些重要抗逆基因的表达特征,对于揭示南极苔藓抗极端环境的机制和极地基因资源的开发具有重要作用。2、JAZ蛋白在南极丝瓜藓适应极端环境中的作用及相关的分子机制研究高盐胁迫是限制许多农作物生长的关键因素。茉莉酸和脱落酸在植物调节盐胁迫的抗性过程中发挥重要作用。之前的研究表明JAZ (jasmonate ZIM-domain)转录抑制因子是茉莉酸信号途径的关键调节蛋白。茉莉酸诱导JAZ蛋白与SCFCOIl泛素连接酶结合,导致JAZ蛋白通过26S蛋白酶体途径被降解。但是,JAZ蛋白在茉莉酸介导的植物对盐胁迫抗性过程中发挥的作用仍然不清楚。本研究中,我们从南极丝瓜藓(Pohlia nutans)中克隆得到一个JAZ(简称PnJAZ9,以下相同)基因,并对该基因的功能进行了较为深入的分析。基因表达水平分析表明,PnJAZ9基因在低温(4℃C)、高盐(200mM NaCl)、聚乙二醇(20% PEG6000)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)胁迫条件下表达水平显著上调；蛋白序列比对分析表明PnJAZ9具有典型JAZ家族蛋白的ZIM和Jas结构域。与拟南芥基因组中的17个JAZ转录因子一起构建系统进化树,表明南极丝瓜藓PnJAZ9基因与拟南芥AtJAZ9(TIFY7)的亲缘关系最近。通过构建"PnJAZ9-绿色荧光蛋白(GFP)”的瞬时表达载体,利用聚乙二醇(PEG4000)介导转化拟南芥原生质体,在激光共聚焦显微镜下观察PnJAZ9蛋白的亚细胞定位情况,发现该基因的表达产物主要定位于细胞核中,仅有少量在细胞质中表达。构建了PnJAZ9的过量表达载体,利用农杆菌侵染拟南芥,筛选和繁种,最终获得过量表达的转基因纯合植株。JAZ蛋白是茉莉酸途径的负调控因子。研究表明,过表达PnJAZ9抑制了茉莉酸信号途径。在100μMMeJA处理条件下,拟南芥PnJAZ9过表达株系的萌发率显著高于野生型植株。实时定量PCR证实拟南芥过表达株系中茉莉酸信号途径关键转录因子MYC2和VSP1的表达水平显著低于野生型植株。利用酵母双杂交证实全长PnJAZ9或者JAZ9(03918)ΔNΔC蛋白都能够与拟南芥AtMYC2、AtMYC3、AtMYC4转录因子相互作用。过表达南极丝瓜藓PnJAZ9增强了转基因植株在种子的萌发和幼苗早期发育阶段对高盐胁迫的抗性。在100mM NaCl处理条件下培养6天时,野生型植株的种子几乎没有萌发,而过表达系AtOE1、AtOE2和AtOE3的种子萌发率分别为47.06%、44.71%和56.47%。同时,过表达南极丝瓜藓PnJAZ9也增强了转基因植株对渗透胁迫的抗性；在0.2M或者0.3M甘露醇胁迫条件下,过表达系(AtOE)的种子萌发率显著高于野生型植株种子的萌发率(处理6天后的种子)。在种子萌发和幼苗早期发育阶段,过表达PnJAZ9提高了植株对ABA胁迫的抗性。在0.25μM ABA处理条件下,过表达系AtOE1、AtOE2和AtOE3的种子萌发率分别是94.87%、84.64%和92.31%(处理6天的种子萌发率),然而野生型植株种子萌发率仅为25.64%。同时,我们发现过表达植株对葡萄糖和生长素(IAA)产生明显抗性,表现出与拟南芥ABI4或ABI5 (ABA途径中的关键转录因子)等突变体相似的表型。由此推测,在转基因植株中,过表达PnJAZ9可能抑制了ABA信号途径中的某些关键的正调控因子例如ABI4和ABI5。进而,我们利用实时定量PCR (RT-qPCR)技术检测了ABA途径中与种子萌发相关的基因的表达情况,发现过表达植株ABA途径中关键调节基因ABI4、ABI5、RD22a、RD29a和MYB2等都呈显著的下调表达模式。综上所述,我们推测南极丝瓜藓PnJAZ9蛋白可能通过与ABA信号途径中的正调控因子相互作用,参与调解植物在高盐胁迫条件下茉莉酸和脱落酸两个信号途径之间复杂的相互作用过程。3、南极丝瓜藓类黄酮羟化酶的系统进化和非生物胁迫下表达模式分析类黄酮是一类广泛存在的植物次生代谢产物,具有多种生物学功能,包括植物的防御反应、抗紫外辐射、生长素转运的抑制、植物化感作用、花器官成色等。黄酮类化合物在植物从水生转移到陆地环境的早期演化过程中发挥重要作用。在类黄酮的合成过程中,类黄酮的羟基化修饰作用对于其显色、稳定性和抗氧化能力的功能至关重要。类黄酮-3’-羟化酶(F3’Hs)和类黄酮-3’,5’-羟化酶(F3’,5’Hs)属于细胞色素P450蛋白家族,它们分别催化类黄酮B环3’或3’,5’位置的羟基化反应。但是,到目前为止在较低等的植物(例如,苔和藓)中类黄酮羟化酶的作用仍然没有报道。本研究中,通过逆转录PCR (RT-PCR)和RACE扩增技术,从南极丝瓜藓中共克隆得到了16条类黄酮3’羟基化酶(F3’H)和类黄酮3’,5’羟基化酶(F3’,5’H)基因的全长序列。蛋白序列比对分析发现,它们都具有典型的类黄酮羟化酶的结构域,即包括富含脯氨酸的“铰链”结构域、EXXR基序、结合氧分子的“口袋”基序和亚铁血红素结合结构域及底物识别位点。之前对类黄酮羟化酶基因的研究报道均指出,来自同一祖先的类黄酮-3’-羟化酶和类黄酮-Y,5’-羟化酶是在裸子植物和被子植物发生进化分离时开始独立进化的。本研究中,通过系统进化分析我们发现,南极丝瓜藓和小立碗藓中类黄酮-3’-羟化酶和类黄酮-3’,5’-羟化酶这两个家族的蛋白都是完全分开的,即类黄酮-3’-羟化酶或者类黄酮-Y,5’-羟化酶分别地聚类在一起。因此,我们确认类黄酮-3’-羟化酶和类黄酮-3’,5’-羟化酶在进化上的分离从苔藓类植物开始就已经发生了。类黄酮羟化酶基因的差异表达、类黄酮羟化酶在细胞中的比例(即F3’H：F3’,5’H)将直接影响类黄酮化合物的种类和分布,最终可能影响植物在逆境胁迫条件下的生存能力。本研究中,我们利用RT-qPCR技术分析发现,低温、高盐、干旱、紫外辐射、植物激素脱落酸和茉莉酸等都能够影响南极丝瓜藓中类黄酮羟化酶基因的表达水平。过表达类黄酮-3’-羟化酶(MFC00060)使植株在种子萌发和幼苗早期发育阶段对NaCl和ABA的抗性降低,但是提高了过表达系植株对过氧化氢胁迫的抗性。黄酮类化合物作为一种活性氧清除剂,其含量体现了不同植物在生化方面对氧化胁迫的抗性能力。因此,我们推测类黄酮-3’-羟化酶与类黄酮-3’,5’-羟化酶可能在南极丝瓜藓适应极地极端生态环境中发挥作用。