论文部分内容阅读
目的:通过沉默或激活PC-9细胞(携带EGFR基因19外显子突变的NSCLC细胞株)中的内源性FGF2表达,同时添加吉非替尼与外源性FGF2,诱导PC-9细胞产生针对EGFR-TKIs快速获得性耐药的状态,筛选出FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的细胞模型,以进一步明确FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药这一全新的耐药模式中所涉及的分子机制。研究方法:1.构建编码靶向FGF2基因shRNA及基于PAS (PCR-based Accurate Synthesis)的慢病毒载体,包装慢病毒,感染人肺癌细胞PC-9,以荧光定量PCR检测FGF2基因在mRNA水平的变化,以western blot检测FGF2蛋白表达水平的变化,筛选出FGF2沉默表达/高表达的细胞株;2.PC-9细胞针对EGFR-TKIs快速获得性耐药状态的诱导及鉴定:对FGF2沉默表达(PC-9-FGF2-KD)或过表达细胞株(PC-9-FGF2-OE)单用吉非替尼或联用外源性FGF2,筛选出耐药细胞株。进一步用相关的生物学指标验证其耐药属性,生物学指标检测包括:(1)以MTS法检测细胞增殖情况;(2)以AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒检测时的细胞凋亡情况,以PI单染法检测细胞周期分布情况;(3)软琼脂实验测定细胞锚定非依赖生长的影响;(4)Transwell法测定细胞迁移和侵袭能力;(5)实时荧光定量PCR法检测获得性耐药相关突变T790M突变和cMET扩增拷贝数。3.以Affymetrix人全基因组3’IVT芯片检测PC-9-NC+FGF2、PC-9-FGF2-KD+FGF2、PC-9-FGF2-OE+FGF2,以及空白对照的PC-9细胞的差异基因表达改变。结果:1.采用慢病毒载体介导的转基因方法构建了FGF2基因沉默和FGF2基因高表达的PC-9细胞,Western Blot检测进一步在蛋白水平对细胞内FGF2的表达改变进行了验证,成功筛选出稳定的FGF2基因沉默(PC-9-FGF2-KD)和FGF2基因高表达(PC-9-FGF2-OE)的PC-9细胞株;2.在FGF2基因过表达的PC-9细胞株(PC-9-FGF2-OE)及给予外源性FGF2的PC-9细胞株中均观察到细胞活力的增加,提示内外源性的FGF2刺激均有可能诱导出PC-9细胞针对EGFR-TKIs的快速获得性耐药;细胞生物学检测进一步表明PC-9-FGF2-OE+FGF2细胞株中出现显著的细胞凋亡率下降、细胞增殖分裂加快、细胞迁移和侵袭能力增强等耐药生物学行为,证实该细胞模型为FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的稳定的NSCLC细胞模型;3.芯片检测发现PC-9-FGF2-OE+FGF2组细胞与PC-9-NC+FGF2组相比较而言,主要产生了PI3K-AKT通路、MAPK通路、ErbB通路和VEGF通路的上调,其中PI3K-AKT信号通路对FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的发生机制可能具有重要意义。结论:1.成功构建出FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的稳定的NSCLC细胞模型,为进一步揭示FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药的分子机制奠定了研究基础;2. PI3K-AKT信号通路可能在FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的发生机制中发挥重要作用。