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研究背景:乳腺癌是世界范围内常见的女性恶性肿瘤之一,位居我国女性恶性肿瘤发病率首位,已成为女性健康的重大威胁。在乳腺癌的死亡病例中,约90%源于乳腺癌的转移。因此,鉴定驱动乳腺癌增殖和转移的关键分子网络将有助于我们深入理解乳腺癌发生发展的分子机制,为乳腺癌筛查和治疗靶点的选择提供科学依据。黏连蛋白(Cohesin)是一种进化上保守的多亚基复合物,能够维持姐妹染色单体黏附,参与同源重组DNA修复,调节基因组的稳定性。近年来发现Cohesin在多种癌症中表达失调。RAD21作为Cohesin的核心亚基,能够调节Cohesin与染色质的结合或解离。越来越多的研究证实RAD21基因可能是导致乳腺癌的驱动基因之一,Rad21既可以介导染色质高级结构形成,也可以作为转录辅因子参与调控MFC、CD44、HOXA 7和TGFB1等多个肿瘤相关的关键基因表达,进而促进肿瘤的发生、发展。作为Hippo信号通路重要的下游效应分子,转录共激活因子YAP(Yes-associated protein)在调控肿瘤细胞的增殖、转移和化疗耐药等方面具有重要作用。然而关于“YAP在乳腺癌发生中的作用”是富有争议的,既有研究报道YAP具有促进乳腺癌细胞增殖和致瘤的能力,也有研究表明YAP发挥抑癌基因的功能。目前尚无研究报道Rad21是否参与调控YAP基因表达,进而影响乳腺癌增殖、侵袭、转移。研究目的:阐明Rad21促进乳腺癌增殖、转移的作用机制。研究方法:利用 Western Blotting 和 Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)检测 RAD21在不同乳腺癌细胞中的表达情况;利用免疫组化方法检测乳腺癌患者肿瘤组织和癌旁组织中RAD21的表达水平;利用靶向RAD21基因的siRNAs降低乳腺癌细胞RAD21基因的表达,利用慢病毒载体构建RAD21低表达的乳腺癌细胞系,通过平板克隆形成实验、EdU掺入实验、CCK8细胞增殖检测实验分析RAD21对乳腺癌细胞增殖能力的影响;利用迁移、侵袭实验检测RAD21对乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响;通过RT-qPCR、免疫荧光以及ChIP实验分析RAD21是否影响YAP基因的转录调控;利用细胞自噬的激活剂、抑制剂分析RAD21对乳腺癌细胞自噬的影响,并通过电镜观察RAD21低表达乳腺癌细胞中的自噬小体,利用Western Blotting检测细胞自噬标志物的表达水平;利用免疫缺陷小鼠进行移植瘤实验,研究RAD21对乳腺癌致瘤和侵袭转移能力的影响。实验结果:1.RAD21在乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中高表达并与患者不良预后相关通过乳腺癌TCGA数据库分析发现RAD21在浸润性乳腺癌患者中的基因扩增和mRNA表达上调比例较高(37%),对RAD21与临床预后关系的分析显示RAD21高表达的乳腺癌患者的预后较差;对乳腺癌患者肿瘤组织的免疫组化分析结果提示,RAD21在癌组织中表达明显高于癌旁组织;与正常的乳腺细胞系MCF-10A相比,RAD21在乳腺癌细胞中表达较高,尤其是在三阴性乳腺癌细胞系中表达最高。2.敲低RAD21影响乳腺癌细胞增殖、侵袭及体内成瘤能力在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549中敲低RAD21能够明显抑制乳腺癌细胞的平板克隆形成能力,减少处于S期的细胞数量;乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力也显著降低,EMT相关蛋白的表达水平明显改变,上皮型标记物表达升高,间质标记物表达降低。移植瘤实验结果显示,RAD21低表达的乳腺癌细胞移植瘤体积明显小于对照组;RAD21高表达的乳腺癌移植瘤体积并没有明显改变,但是与对照组相比,其Ki-67阳性细胞比例明显增加。3.RAD21在乳腺癌中负调控YAP基因表达我们分析低表达RAD21的MDA-MB-231细胞RNA-Seq数据和文献报道的YAP可能调控的靶基因,发现低表达Rad21引起的差异表达基因中有超过1/3的基因可能受YAP调控,表明乳腺癌中Rad21的功能或许与YAP相关。我们发现RAD21在YAP基因的启动子区域有结合峰,YAP基因也可能是RAD21调控的靶基因之一。ChIP实验结果表明RAD21可以结合在YAP基因的启动子区域。在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549中敲低RAD21基因后,YAP的蛋白水平明显升高,并且YAP蛋白在细胞核中的分布显著增加。此外,YAP下游靶基因的表达水平也明显升高。在RAD21基因高表达的MDA-MB-231细胞系中,YAP蛋白水平则是明显下降。在乳腺癌患者的肿瘤组织中,我们观察到YAP蛋白的低表达或不表达。4.RAD21对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响依赖于YAP在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,同时敲低RAD21基因与YAP基因可以拯救由于RAD21基因低表达所导致的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的降低。5.敲低RAD21促进乳腺癌细胞自噬在低表达RAD21基因的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,电镜分析发现与对照细胞相比,敲低组细胞自噬小体明显增加;而自噬相关分子标记物LC3-Ⅱ的蛋白水平明显减少,这表明细胞自噬水平增强引起LC3-Ⅱ的蛋白降解加快。分别利用自噬激活剂(雷帕霉素)和自噬抑制剂(氯喹、巴弗洛霉素A1)处理乳腺癌细胞MDA-MB-231,实验结果证实敲低RAD21基因后可促进乳腺癌细胞的细胞自噬。但当同时敲低乳腺癌细胞MDA-MB-231的R4D21基因和YAP基因后,细胞内LC3-Ⅱ的蛋白水平则明显累积,细胞自噬水平受到抑制。高表达RAD21基因的乳腺癌细胞MDA-MB-231中,YAP蛋白水平明显降低,LC3-Ⅱ的蛋白水平则累积,细胞自噬进程受阻。结论:1.RAD21在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中高表达并与患者不良预后相关;2.敲低RAD21可降低乳腺癌细胞的增殖、迁移侵袭及体内成瘤能力;3.RAD21在乳腺癌中负调控YAP基因的表达,且RAD21对乳腺癌生物学功能的影响依赖于YAP;