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试验以扶芳藤和大叶黄杨为试材,以无芽茎段和下胚轴为外植体,以MS培养基为基本培养基,研究其植株再生的条件,主要就影响不定芽再生的生长调节剂组合与浓度、培养基组成以及外植体预培养时间等外部因素进行了探索,应用石蜡切片技术对不定芽的起源进行了观察,并进行了农杆菌介导的p5cs转化扶芳藤的研究。主要试验结果如下:
以扶芳藤的无芽茎段和下胚轴为外植体,建立了稳定高效的不定芽再生体系。MS+6-BA(1.5 mg·L<-1>)+lBA(0.1 mg·L<-1>)和MS+6-BA(1.3 mg·L<-1>)+NAA(0.1 mg·L<-1>)对诱导扶芳藤无芽茎段产生不定芽最为有利,再生率为82.6%和78.6%;不定芽主要发生在外植体的中部和邻近切口的膨大处。以下胚轴为外植体时,将外植体预培养50d更有利于不定芽的诱导,中浓度的6-BA(1.3 mg·L<-1>和1.5 mg·L<-1>)对下胚轴直接分化产生不定芽有利,NAA(0.1 mg·L<-1>)比相同浓度的IBA更有利于不定芽的诱导。培养基MS+6-BA(1.5 mg·L<-1>)+NAA(0.1 mg·L<-1>)和MS+6-BA(1.3 mg·L<-1>)+NAA(0.1 mg·L<-1>)上不定芽再生率最高,分别达到95.7%和89.1%,外植体上平均产生不定芽的数量达3.69个和4.78个。以绵白糖和蔗糖为碳源均能达到较好的再生效果(80%以上),以葡萄糖为碳源时再生率虽然高达100%,但玻璃化严重。生根培养基以1/2MS+IAA(0.7 mg·L<-1>)最好,生根率高达92.9%,经驯化后移栽成活率在90%以上。
以大叶黄杨无芽茎段和下胚轴为外植体,建立了不定芽再生体系。以MS+6-BA1.7mg mg·L<-1>+lBA0.005 mg·L<-1>和MS+6-BA1.7 mg·L<-1>+IAA0.005 mg·L<-1>为诱导培养基有利于大叶黄杨无芽茎段的分化,多数不定芽产生于外植体的近切口处,再生率分别达到52.4%和40.0%;20g·L<-1>的白糖,30g·L<-1>的蔗糖和葡萄糖为碳源对诱导大叶黄杨无芽茎段产生不定芽有利。以1/2MS+6-BA1.7mg·L<-1>附加0.01mg·L<-1>或0.005mg·L<-1>IBA为诱导培养基时,下胚轴分化产生不定芽效果最好,分化率达40.0%;以1/2MS+IAA0.5mg·L<-1>可有效地诱导不定根。
以扶芳藤和大叶黄杨的下胚轴和无芽茎段为外植体进行离体培养时,不定芽起源于外植体的表皮。培养过程中,部分表皮细胞恢复分裂并形成分生区,进而外植体表面出现绿色突起,进一步培养后形成芽原基,并最终发育成完整芽,以新形成的维管组织与外植体相连。
利用农杆菌介导法,成功的把P5CS基因转入扶芳藤中。最适宜扶芳藤下胚轴转化的菌液浓度为OD<,600>=0.5,感染时间为30min、共培养时间为48hr。PCR检测抗生素筛选阳性株的转化率为94.6%,PCR-Southern检测呈阳性反应。