背景和目的: 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是肝糖异生的限速酶。内毒素血症性休克时，低血糖的发病机理是炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)抑制PEPCK的表达，且这种抑制作用发生在转录水平。PEPCK基因的转录受多种激素的调控，其中最重要的调节激素是胰高血糖素(通过第二信史cAMP)和胰岛素。转录因子CREB是胰高血糖素诱导PEPCK基因转录所必需的因子，其转录活性受辅激活子的调节，如SRC-1，CBP和TORC2等，但是否存在辅抑制物参与调节CREB的活性仍然未知。有研究报道NF-кB p65能抑制糖皮质激素或cAMP诱导的PEPCK的转录，p65与CBP的相互作用可能介导了p65对PEPCK的抑制。辅抑制物是否亦参与这种相互作用仍有待阐明。因此，为了研究TNF-α抑制作用的分子机制，我们探讨了转录因子CREB、NF-кB p65和辅抑制物如何参与调节肝细胞PEPCK基因的转录。 材料与方法: 1. 细胞模型： 1)大鼠H4IIE肝细胞瘤株和人HepG2肝细胞瘤株作为肝细胞模型； 2. 实验方法： 1)大鼠H4IIE肝细胞株经cAMP和TNF-α处理，观察PEPCK mRNA水平和蛋白水平; 2)用激酶特异性化学抑制剂预处理H4IIE细胞，观察TNF-α抑制PEPCK基因转录所用的信号通路； 3)用人Hep32肝细胞瘤株和人HepG2 sslкBα稳定表达细胞系(能稳定表达超抑制IкBα，即sslKBa，IкBα非降解形式)，进行基因转染，观察sslкBα对PEPCK基因启动子活性(通过报道基因PEPCK-LUC的荧光素酶活性反映)的影响，进一步证实TNF-α抑制PEPCK基因转录的信号通路； 4)大鼠H4IIE和人HepG2 sslкBα~稳定表达细胞系经cAMP和TNF-α处理，观察HDAC3的胞浆和胞核穿梭情况； 5)用HDACs化学抑制物(butyrate，TSA)抑制HDACs活性和RNA干扰技术特异性沉默辅抑制物，研究TNF-α抑制PEPCK基因转录所需辅抑制物： 6)用染色质免疫共沉淀(CHIP)结合实时定量RT-PCR(qRT-PCR)，研究PEPCK基因启动子与转录因子CREB和辅抑制物HDAC3-SMRT的相互作用； 7)用蛋白质免疫电泳检测CREB的磷酸化水平及PGC-1的表达是否受TNF-α的影响； 8)CRE-LUC报道基因瞬时转染于人HepG2细胞株，用RNA干扰技术特异性沉默辅抑制物，研究TNF-α抑制CREB转录活性所需辅抑制物； 9)定点突变PEPCK启动子经典CRE元件(CRE1，-91/-84)(T→G)，检测cAM P和TNF-α,对报道基因活性的影响，证实TNF-α抑制PEPCK基因启动子的作用靶点。 10)为了研究辅抑制物在p65介导的TN F-α对PEPCK基因转录抑制中的作用，人HepG2细胞株和人HepG2 sslкBα稳定表达细胞系瞬时共转染PEPCK-LUC和p65，用RNA干扰技术特异性沉默辅抑制物，观察PEPCK基因启动子活性的改变。 3. 统计学方法：每次试验均重复二三次以上并得出一致的结果。计量资料以均数±标准差描述其特征，两组间比较采用t检验或ANOVA检验，统计处理采用SPSS 10.0 for Windows软件，以双侧P<0.05为有统计学差异的标准。 结果与讨论: 1.TNF-α抑制cAMP介导的PEPCK基因的转录和蛋白表达。 2.阿司匹林和LY294002(两者均能阻断TNF-α对NF-кB的激活)能阻断TNF-α对PEPCK基因转录的抑制作用，提示TNF-α激活IKK/NF-кB通路从而抑制PEPCK表达。 3.表达超抑制IкBα(sslкBα，非降解IкBα)完全阻断TNF-α对PEPCK基因启动子活性的抑制，进一步证实TNF-α对PEPCK基因的抑制作用发生在转录水平，且这种抑制作用依赖于IкBα的降解。 4.TNF-α能诱导HDAC3转位于胞核，同时胞浆中IкBα发生降解。IкBα能控制HDAC3的核转位。IкBα的降解和p65的核转位参与了TNF-α对PEPCK的抑制。 5.HDACs的化学抑制物(butyrate和TSA)能完全阻断TNF-α对PEPCK的抑制。沉默HDAC3或SMRT均能阻断TNF-α对PEPCK的抑制，提示HDAC3和SMRT是参与PEPCK基因转录的辅抑制物，两者形成复合体抑制PEPCK基因转录。 6.染色质免疫共沉淀(CHIP)结果显示cAMP能增强CREB、Pol Ⅱ与PEPCK基因启动子结合，组蛋白乙酰化信号亦增强，同时HDAC3-SMRT与启动子的结合减弱；而TNF-α则与其相反，能减弱CREB、Pol Ⅱ和组蛋白乙酰化信号，同时增强HDAC3-SMRT与PEPCK基因启动子结合。以上彼此相反的结果提示TNF-α能增加辅抑制物的活性，使组蛋白乙酰化减弱，从而降低CREB和Pol Ⅱ的活性。TNF-α使HDAC3-SMRT与PEPCK基因启动子相互作用进而抑制PEPCK转录，CRE1(-91/-84)可能是作用的靶点。 7.TNF-α没有改变CREB蛋白的磷酸化，提示CREB蛋白的磷酸化并不参与TNF-α对PEPCK的抑制。TNF-α亦不能改变PGC-1(CREB的共激活物)的表达，故PGC-1也不参与TNF-α的抑制作用。TNF-α可能通过辅抑制物HDAC3修饰染色质，从而减弱CERB与DNA的结合活性。 8.CREB的转录活性(CRE-LUC报道基因活性)可被TNF-α抑制，而表达sslкBα或沉默HDAC3或SMRT均能阻断TNF-α的抑制作用，提示HDAC3-SMRT复合体通过抑制CREB活性进而抑制PEPCK基因转录。 9.点突变PEPCK基因启动子的CRE2(-91/-84)元件后，cAMP诱导的报道基因的活性比正常减弱50﹪，而TNF-α不能发挥对其的抑制作用，提示CREB是TNF-α抑制PEPCK基因转录所必需的，经典CRE元件(CRE1,-91/-84)是PEPCK启动子上与CREB结合的最主要的位点，亦是TNF-α抑制PEPCK基因转录的靶点。 10.p65共转染抑制PEPCK基因启动子活性，表达sslкB α完全阻断p65对PEPCK基因启动子活性的抑制。而在HepG2 sslкB α稳定表达细胞系，p65共转染不能抑制PEPCK活性。这些数据进一步提示TNF-α的抑制作用依赖于IкBα的降解和NF-кB的核转位。沉默HDAC3或SMRT均能阻断p65对PEPCK的抑制，这一结果提示p65的作用依赖于辅抑制物HDAC3和SMRT。 结论: 1.NF-кB p65介导了TNF-α对PEPCK基因转录的抑制。 2.HDAC3-SM RT复合体是TNF-α抑制PEPCK基因转录的辅抑制物，TNF-α通过激活IKK/NF-кB进而释放辅抑制物HDAC3-SM RT参与抑制CREB介导的PEPCK基因转录。 3.HDAC3-SM RT复合体是CREB的辅抑制物，其参与调节CREB的转录活性从而影响PEPCK基因转录。 4.TNF-α通过抑制CREB的活性进而抑制PEPCK基因转录，经典CRE元件(CRE1，-91/-84)是TNF一0t,发挥抑制作用的靶点。 5.转录因子NF-кB p65和CREB共享相同的辅抑制物HDAC3-SM RT。TNF-α活化NF-кB p65后，HDAC3-SM RT从NF-кB p65移除而被CREB募集并与其结合。NF-кB p65和CREB交换辅抑制物介导了NF-кB p65对PEPCK基因转录的抑制。 综上所述，本研究结果提示NF-кB p85介导了TNF-α对PEPCK基因转录的抑制，这一抑制作用依赖于辅抑制物HDAC3-SMRT的活性，CREB是辅抑制物作用的靶点。我们的研究提出了一个关于辅抑制物如何参与TNF-α对糖代谢调节的新机制。