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荧光分析法有操作简单、灵敏度高,且能达到实时检测等优点,深受生物化学家的广泛关注。然而,大部分荧光探针的波长范围位于可见光区域,而可见光区域的荧光成像存在生物背景干扰大、光漂白等问题,近红外荧光染料具有低背景荧光信号、深的组织穿透性、小的光损伤等特点,因此开发高荧光量子产率、高稳定性和低毒性的近红外荧光染料引起了人们的高度重视。其次大多数荧光探针的响应机理是增强型,易受探针本身的浓度和外界环境等其他因素的干扰,降低了测量的准确性。比率型荧光探针能够通过双通道的比率检测达到消除探针自身浓度的干扰、仪器的效率和环境因素差异等带来的检测的误差,比率型的荧光探针在生物成像中具有广泛的应用前景。在本论文工作中,我们设计、合成了系列具有近红外发射波长的新型荧光染料,并对其光学性能进行了详细的研究,最后基于这些染料发展了新型的比率型荧光探针用于硝基还原酶和L-半胱氨酸的检测,具体内容如下:(1)针对2,4,6-三苯基吡喃盐(TPP)存在稳定性差、荧光量子产率低的问题,对其分子结构进行修饰,设计合成了系列具有较好稳定性的三苯基吡喃盐类荧光染料,并详细研究了其光学性能。与母体染料相比,这些染料的稳定性显著改善,并具有较高的量子产率和大的Stokes位移等优点。染料的荧光发射波长能通过修饰其氨基进行调控。我们进一步利用TPPF7发展了硝基还原酶(NTR)的比率型荧光探针,该探针能应用于不同缺氧状态下细胞内NTR的检测。(2)我们将HD近红外染料和荧光素染料进行整合,发展了一类新颖的“智能型”近红外荧光染料HDFL。HDFL具有高的化学稳定性和光稳定性以及近红外发射的特点,同时通过调控染料上的羟基功能团,染料的发射波长发生显著移动,并且发生电荷反转,具有“智能”靶向的特点。在此基础上,我们开发了新颖的近红外比率探针HDFL-Cys,该探针可以快速灵敏的检测L-半胱氨酸(Cys),而且生物成像实验表明HDFL-Cys可以先在线粒体内积累,然后与分析物Cys反应。此外,HDFL-Cys还可以通过监测正常细胞和癌细胞的Cys的含量的差异来区分正常细胞和癌细胞。