论文部分内容阅读
芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra Bailey)是十字花科重要蔬菜之一，其风味别致、营养价值高，深受消费者欢迎。但是，在芥蓝的栽培过程中常常会受到各种逆境的侵害，给生产造成很大损失。近几年随着生物技术的发展，已经可以采用转基因技术对芥蓝的性状进行改良。
翻译控制肿瘤蛋白(The translationally controlled tumor protein，TCTP)是一类广泛存在于动物、植物及酵母中的，在进化上高度保守、与其它任何蛋白家族均未显示出明显的序列同源性的蛋白。植物TCTP的功能主要有促进细胞增殖和植物生长、抗高低温、盐碱、重金属等逆境条件的作用。本研究利用转基因技术将结球甘蓝抗逆相关基因BoTCTP转化到芥蓝中，旨在探索该基因更多潜在的功能，深入阐明植物抗逆分子机制，为开展植物抗逆基因工程研究提供材料。主要取得了以下研究结果：
1.构建植物表达载体
根据结球甘蓝抗逆相关基因BoTCTP序列设计特异引物，经PCR扩增得到约750bp目的片段，随后目的片段连接到T载体上，用BamHI和NcoI双酶切后回收小片段，再和回收到的pFGC5941载体片段转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落提取质粒，用BamHI和NcoI双酶切检测，然后把构建好的表达载体利用冻融法转到农杆菌LBA4404中，保存，以备遗传转化之用。
2.芥蓝的遗传转化
通过对不同消毒方式、抗生素浓度等因素对芥蓝遗传转化影响的探讨，最终确定芥蓝的遗传转化体系为：种子经0.1％的升汞消毒10min后，播种于1/2MS培养基上获得无菌苗；以7-8d苗龄（即微露顶芽）的带下胚轴的子叶作为外植体，在分化培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+7.0mg/LAgNO3中预培养2d；浸入用MS液体培养基悬浮至OD600≈0.5的农杆菌菌液中侵染8min，无菌纸吸去残留菌液，重新接入分化培养基中共培养2d；转接至含Cef的抑菌培养基上(MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+7.0mg/LAgNO3+300mg/LCef)，抑菌培养7d，抑制农杆菌的生长；然后接入含PPT的筛选培养基中(MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+7.0mg/LAgNO3+300mg/LCef+一定浓度的PPT)，两周继代一次，对获得的不定芽进行多代筛选，PPT浓度为5-10mg/L，筛选浓度逐渐升高，至最后获得少数具PPT抗性的绿色芽；将伸长至2-3cm高的不定芽切下，转到生根培养基上(1/2MS+0.2mg/LNAA)诱导生根，获得抗性小苗；待根粗壮后炼苗、移栽。
3.抗性植株的分子生物学检测
改良CTAB法提取抗性植株的基因组DNA，根据Bar基因序列设计引物进行PCR扩增检测。将检测为阳性的PCR产物送去测序，将测序结果在gene bank中与Bar基因对比，同源率高达99%。再经Southern杂交后，最终得到了4棵转基因植株，其外源目的基因已经整合到受体基因组中，1株以双拷贝形式存在，另外3株以单拷贝形式存在，并且得到表达。
4.转基因植株的功能鉴定
对检测为阳性的植株进行了与生长相关以及高低温、盐碱、重金属等逆境胁迫实验，结果表明阳性植株相对于阴性对照生长加快、叶片面积较大、株高明显高于对照等。在各种逆境胁迫下，转基因植株对胁迫的忍受力明显优于对照植株。从而表明BoTCTP基因与芥蓝的生长密切相关，且对芥蓝的抗逆性起一定的调控作用。