论文部分内容阅读
研究目的:在泌尿系统肿瘤中,膀胱癌以其高发病率及高死亡率一直以来都是人们研究的热点,但是临床上一直缺乏一种较为有效的膀胱癌的治疗方法。BRE(The brain and reproductive expression),又称BRCC45(BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 45),是一种死亡受体相关的抗凋亡蛋白,与体内肿瘤的生长密切相关。一些研究证明BRE在很多肿瘤以及其他疾病中都扮演着非常重要的角色,为了进一步研究抗凋亡蛋白BRE在膀胱癌发病中的作用,了解其在膀胱癌发生发展中发挥功能的分子机制,我们对此进行了研究。研究方法:通过使用QPCR和western blotting的方法,我们分析了BRE在膀胱癌四种细胞系EJ,T24,BIU,5637以及正常膀胱细胞HCV29中的表达量。而且,我们还对6对膀胱癌及癌旁组织进行了分析,进一步验证BRE基因的表达量。另外,通过慢病毒介导的shRNA干扰技术,我们分析了BRE在膀胱癌的细胞周期及细胞增值中的作用。在体内和体外实验中,通过沉默BRE的表达来研究BRE的各种生物学功能。结果:利用QRT-PCR和western blotting的方法,我们得知,与正常膀胱细胞HCV29细胞相比,四种膀胱癌细胞系EJ,T24,BIU,5637中BRE的表达含量不管是在mRNA水平上还是在蛋白水平上均较高。我们用此方法同样检测了6对膀胱癌及癌旁组织中BRE的表达量,结果进一步证实了膀胱癌组织中BRE的表达量不管是在mRNA水平上还是在蛋白水平上均明显高于癌旁组织。然后我们利用[3H]-TdR掺入法分析了在沉默BRE表达后,膀胱癌细胞系T24,EJ的增值情况,结果显示,转染shBRE的EJ和T24细胞,与对照组相比,细胞的增值活性均明显降低。并且在一定程度上影响了细胞周期中的G2/S期。然后,我们用western blotting的方法分析了细胞周期相关蛋白Cyclin B1和CDK1的表达,结果显示,与对照组相比,沉默BRE的EJ和T24细胞,Cyclin B1和CDK1的蛋白表达量均明显减少。采用BrdU染色技术来分析BRE基因敲除的患者细胞的增值过程。研究结果显示,沉默BRE基因的细胞,与对照组相比较,其增值过程中S期缩短,而G0-G1和G2-M期延长。我们还用Ki67染色技术分析了患者细胞的增殖期的变化。我们观察到沉默BRE基因的细胞,与对照组相比较,其增值过程中G0期延长,而非G0期缩短。在DDP IC50药物抑制试验中,我们发现与对照组比较,BRE沉默的膀胱癌细胞系EJ,T24,BIU,5637以及膀胱癌患者的细胞,在抑制其增殖中所用的DDP IC50剂量明显较少。我们用QPCR,western blotting以及免疫荧光技术分析得出,在CD133+细胞和ALDH+细胞中,BRE的表达含量均明显高于CD133-细胞和ALDH-细胞。在体内实验中,相同数量的沉默BRE的膀胱癌细胞和对照组相比,成瘤率明显较低,并且小鼠在到达相同的无肿瘤生存期时,所需要的BRE基因沉默的EJ或者T24细胞的数量明显较多。结论及意义:BRE基因能够促进膀胱癌细胞的生长,在膀胱癌的肿瘤形成和发展中扮演了非常重要的角色,因此,针对BRE的靶向治疗对于膀胱癌患者来说也许是一种很好的治疗方式。