【目的】铁死亡(Ferroptosis)是一种以铁过载和脂质过氧化为特征的细胞死亡形式,在神经退行性疾病中发挥了重要作用。而脂质过氧化也是脊髓继发性损伤中的关键因素。有研究报道自由基清除剂依达拉奉(Edaravone,EDV)对大鼠脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)具有一定的疗效,但其确切机制未完全阐明,本研究旨在探索Edaravone是否可以干预铁死亡达到修复大鼠脊髓损伤的目的。【方法】1.大鼠脊髓损伤模型制作本实验利用Impactor Model-III型打击器(10 g×25 mm)制备大鼠T10节段脊髓挫伤模型。2.动物实验分组实验动物采用Wistar大鼠(雌性、8周龄、200g左右)共计63只,随机分为3组:Sham组,Injury组,Injury+EDV组。3.体外实验分组选取适量SH-SY5Y进行铺板,随机分为以下组别:PBS组、DMSO组、10μM Erastin组、10μM Erastin+1μM EDV组、10μM Erastin+10μM EDV组、10μM Erastin+20μM EDV组、10μM Erastin+50μM EDV组以及PBS组、DMSO组、10μM Erastin组、10μM Erastin+50μM EDV组。4.Edaravone治疗作用评价4.1.大鼠后肢运动功能评价SCI后对3个实验组进行BBB评分和斜板实验,时间点分别为1d、7d、14d、21d及28d;HE染色评价4周时间点各实验组损伤中心组织结构变化。4.2.体内铁死亡通路关键蛋白表达检测SCI后2d和7d对3个实验组脊髓组织取材,蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、系统Xc~-轻链(xCT)、乙酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)以及5-脂氧合酶(5-LOX)的表达水平。4.3.脂质代谢组学定量分析液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)定量检测SCI后2d时间点脊髓样本32种花生四烯酸和37种ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢产物的表达水平。4.4.神经炎症相关指标检测各实验组脊髓样本于SCI后4周进行胶质纤维酸性蛋白GFAP荧光染色;WB检测SCI后2d时间点Iba-1表达水平;应用细胞因子抗体阵列分析SCI后1d和3d时间点相关细胞因子的表达程度。4.5.评价神经元存活情况SCI后4周对各实验组脊髓样本进行NeuN荧光染色。4.6.评估Edaravone对SH-SY5Y细胞铁死亡的影响MTT分析7个体外实验分组细胞培养24h后的细胞存活率;PI/Hochest检测4个体外实验分组培养12h后的细胞死亡情况。4.7.体外铁死亡通路关键蛋白表达检测WB检测体外4个实验分组细胞培养24h后GPX4、xCT、ACSL4以及5-LOX的表达水平。4.8.评估体外脂质过氧化水平MDA检测试剂盒定量分析体外4个实验分组细胞培养8h后的MDA表达水平;MitoPeDPP特异性分析体外4个实验分组细胞培养3h后线粒体脂质过氧化水平。【结果】1.依达拉奉改善脊髓损伤大鼠后肢运动功能评分Sham组第1d时的BBB评分为21分,而Injury组和Injury+Edaravone组的评分均为0分,证明大鼠SCI模型有效。与SCI组相比,依达拉奉治疗后不仅可显著增加损伤后7d、14d、21d和28d时BBB运动功能评分而且在14d、21d及28d的斜板试验中拥有更高的维持角度。脊髓组织在损伤后4周留有明显的空洞。而与SCI相比,依达拉奉却明显减少了空洞面积,显著保护了脊髓组织的丢失。2.依达拉奉调节大鼠脊髓损伤后铁死亡通路相关蛋白表达水平与Sham组相比,xCT和GPX4表达水平在SCI后2d和7d时间点的表达均显著降低,而依达拉奉治疗后明显逆转了这一趋势。相反,ACSL4和5-LOX在SCI后2d时间点的表达明显升高,而依达拉奉则显著减少了这两种铁死亡标志物的表达水平。与xCT和GPX4不同的是,ACSL4和5-LOX在7d时的表达水平在各实验组之间并无差异。3.依达拉奉明显降低损伤后5-LOX代谢产物水平SCI组和Edaravone组2d时间点的5-LOX代谢产物LXA4的检测结果分别为351.74±118.56以及151.80±53.38。而5-LOX的其他代谢物如5-羟基乙酸(HETE)、白三烯B4(LTB4)以及12-LOX代谢物12-HETE和15-LOX代谢物15-HETE在两组之间并没有明显变化。4.依达拉奉抑制大鼠脊髓损伤后发生的神经炎症依达拉奉明显抑制损伤后4周星型胶质细胞增生并减少损伤后2天Iba-1的表达。IL-6在损伤后1天和3天明显上调而依达拉奉明显抑制这一趋势。相反,脂联素(Adiponectin)在相应时间点下调,依达拉奉显著提高了Adiponectin水平。5.依达拉奉保护脊髓神经元并抑制体外神经细胞系死亡与Sham组相比,SCI后4周NeuN阳性神经元数量明显减少。而依达拉奉显著增加了NeuN阳性荧光细胞数量,反映了有更多神经元的存活。MTT法测定结果显示与DMSO组相比,Erastin可显著降低SH-SY5Y细胞存活率。除了1μM浓度以外,SH-SY5Y细胞存活率在依达拉奉处理后呈剂量依赖性增加。PI/Hoechst染色呈现同样的趋势。6.依达拉奉调节体外细胞铁死亡通路并降低线粒体脂质过氧化水平SH-SY5Y细胞系暴露于Erastin后,xCT和GPX4的表达均明显降低。而不同浓度依达拉奉处理后GPX4和xCT的表达水平呈剂量依赖性增加。相反,WB显示ACSL4和5-LOX的表达显著增加且它们的表达水平经依达拉奉处理后均呈剂量依赖性降低。PBS组、DMSO组、10μM Erastin组、10μM Erastin+50μM Edaravone组MDA水平分别为7.77±1.34、7.88±0.25、27.82±1.05以及6.36±0.48。MitoPeDPP显示Erastin增加了线粒体脂质ROS,而Edaravone完全抑制了这一现象。【结论】1、依达拉奉修复大鼠脊髓损伤的作用是通过调节xCT/GPX4/ACSL4/5-LOX铁死亡途径以及重新平衡脂质氧化内稳态来实现的。2、依达拉奉减少5-LOX代谢产物从而抑制神经炎症。3、依达拉奉促进脊髓损伤后神经元存活并阻止神经元细胞系发生铁死亡。