【摘 要】
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谷氨酸受体（Glutamatereceptors;GLRs）是一类具有保守结构域的氨基酸门控钙离子通道,它在调控植物信号转导方面发挥着重要的作用。GLRs通过协调钙离子、电信号与活性氧信号等参与了植物的各种生理过程,并且在抵御非生物胁迫如干旱、低温、盐胁迫等以及生物胁迫如真菌、细菌、线虫侵染的过程中发挥着重要的作用。然而大多数GLRs的研究都集中于拟南芥、番茄、水稻等,而烟草中的GLRs鲜有报道,
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谷氨酸受体（Glutamatereceptors;GLRs）是一类具有保守结构域的氨基酸门控钙离子通道,它在调控植物信号转导方面发挥着重要的作用。GLRs通过协调钙离子、电信号与活性氧信号等参与了植物的各种生理过程,并且在抵御非生物胁迫如干旱、低温、盐胁迫等以及生物胁迫如真菌、细菌、线虫侵染的过程中发挥着重要的作用。然而大多数GLRs的研究都集中于拟南芥、番茄、水稻等,而烟草中的GLRs鲜有报道,且GLRs在调控植物抵御病毒侵染的具体分子机制尚不明确。为了研究GLRs在调控植物响应病毒侵染过程中的作用,本研究首先在本氏烟中搜索比对到了 12个含有完整功能结构域的NbGLRs。根据系统进化分析,这12个NbGLRs主要有3个分支,其中分支Ⅰ只有一个成员,分支Ⅱ有5个,分支Ⅲ有6个。通过对这些成员的结构域进行分析发现,它们都含有GluR-Plant结构域,有的还含有Lig-chan,PBP1-GABAb-receptor-plant结构域,这些都是构成植物GLRs的重要结构域。多重比对发现它们在N端和C端同源性不高,而在中间的几个功能结构域都较为保守。通过组织特异性表达分析发现,12个NbGLRs在根、茎、叶中均有表达,分支Ⅱ的表达主要集中在根部,而分支Ⅲ主要在叶片表达。接下来我们运用了多种分子生物学方法研究了 NbGLRs在抵御烟草花叶病毒（TMV）侵染中的作用。首先我外施GLRs激动剂L-Glu及其抑制剂DNQX然后接种TMV,结果发现L-Glu预处理能够显著降低TMV的复制量,而DNQX则促进了病毒的积累。进一步研究发现L-Glu预处理能够诱导钙离子内流,促进早期ROS的积累,并激活SA的合成及其信号转导途径,而DNQX处理则抑制了这些反应。因此这些结果表明,GLRs的激活可以增强钙离子内流,促进ROS和SA合成,激活SA信号转导途径,减少TMV的积累量,增强烟草对TMV的抗性。接下来我检测了 TMV侵染不同时间段后烟草体内Glu含量和12个NbGLRs表达量的变化情况,结果发现TMV侵染能够诱导烟草体内Glu含量的增加,并且在12 h时达到峰值,同样TMV侵染也能够诱导大部分NbGLRs的表达,但只有NbGLR3.3在侵染的早期被诱导。由于NbGLR3.3响应TMV侵染最迅速,并且在根、茎、叶中都有较高的表达,因此我重点研究了NbGLR3.3在抵御TMV侵染过程中的作用。我从本氏烟基因组中克隆出了NbGLR3.3全长基因,其开放阅读框为2793 bp,共编码930个氨基酸,分子量为102.66 kDa,其中Leu和Ser含量最高。通过对其结构进一步分析发现,NbGLR3.3为一个疏水性蛋白,含有4个跨膜区,并且N端存在信号肽。通过亚细胞定位分析发现,NbGLR3.3-GFP主要定位在细胞膜上并且可以和膜定位Maker的红色荧光信号重叠,这也就表明NbGLR3.3确实定位在细胞膜上,能够作为Ca2+通道发挥作用。我进一步通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）沉默了NbGLR3.3,qPCR结果显示NbGLR3.3在叶片中的表达得到了抑制。在接种TMV后我发现在沉默植株中病毒的复制量要显著高于对照,因此沉默NbGLR3.3能够显著降低本氏烟对TMV的抗性。另外在沉默植株的原生质体中Ca2+内流的能力显著受阻,并且病毒侵染早期的ROS积累也显著低于对照,同时SA含量及其信号转导相关基因的表达量也受到了抑制。综上所述,我在本氏烟中共鉴定出了 12个NbGLRs家族成员,其中NbGLR3.3可能在抵御TMV侵染过程中发挥着主要的作用,它可以通过调控Ca2+信号从而激活ROS产生以及SA介导的信号通路,促进本氏烟对TMV侵染的抗性。我的研究结果为NbGLRs在响应生物胁迫中发挥的重要作用提供了研究基础,也为提高植物抗病性,培育抗病品种以及绿色防控提供了理论上的支持。
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