目的:食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤,我国90%以上的食管癌病理类型为鳞状细胞癌。尽管现代肿瘤治疗技术明显提高,食管癌患者死亡率仍高居恶性肿瘤致死率的第4位,5年总生存率仅为15%～25%左右。临床上,40%～50%的患者在确诊时已发生局部侵犯或远处转移,放化疗是治疗进展期食管癌的最主要手段,但患者中位生存期仅5～10个月。食管鳞状细胞癌中存在遗传物质的多种基因序列变异,多种因素引起的基因过度表达,是导致食管癌发生、发展的重要机制。通过对食管癌发生、进展、复发及转移过程中分子生物机制的研究,食管癌的分子靶向治疗应运而生。目前有部分针对食管癌的分子靶向药物已进入II期临床试验,但研究结果不尽人意。食管癌的肿瘤异质性及治疗过程中耐药的产生,可能是导致分子靶向药物疗效不佳的原因。因此,寻找更可能产生良好疗效的分子靶点,探索新的预测疗效和预后的生物标志物,筛选优势获益人群,对食管癌早期诊断及改善预后意义重大。富含亮氨酸α-2糖蛋白1(leucine-2-glycoprotein1,LRG1)是亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)蛋白家族成员之一,是由Haupt和Baudner最先于1977年在人类血清中发现的微量蛋白。LRG1在病理组织、外泌体、血液、脑脊液等处的异常高表达与多种恶性肿瘤的发生、发展相关,且这种异常表达可能提示患者预后不良。然而,它是否参与食管鳞状细胞癌(ESCC)的进展尚不清楚。本课题中,我们探讨了 LRG1在食管鳞癌中的表达水平及其生物功能意义。方法:以LRG1和食管鳞癌为研究对象,研究分为以下三个部分:1.第一部分:LRG1与食管鳞癌临床病理及生存预后的相关性分析。(1)分别采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)、免疫蛋白印迹(Western blot)方法检测LRG1在食管鳞癌组织及正常食管组织中的表达;免疫组织化学染色(IHC)技术检测LRG1在不同食管鳞癌组织中的表达差异。(2)Pearson’s χ2检验分析LRG1表达水平与食管鳞癌患者临床病理参数间的相关性,并采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析LRG1对食管鳞癌患者的生存预后价值。(3)采用单变量Cox分析对纳入病例的临床特点和LRG1表达水平做单因素分析,选取单因素分析中有预后价值的变量做多因素Cox分析,评估LRG1是否对食管鳞癌患者生存预后有临床应用价值。2.第二部分:LRG1影响食管鳞癌细胞增殖、凋亡及侵袭的体外实验。(1)构建下调LRG1表达的sh-LRG1质粒,即sh-LRG1-1和sh-LRG1-2,以sh-NC作为阴性转染对照,通过质粒转染下调食管鳞癌细胞株的LRG1表达水平。分别采用RT-PCR、Western blot技术对2种食管鳞癌细胞系Eca109和KYSE150对应的sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组、sh-NC组中LRG1 mRNA和蛋白的表达进行检测,确定转染后的食管癌细胞中LRG1呈现低表达。(2)通过CCK8实验、克隆集落形成实验、Hoechst染色分析实验和Transwell侵袭实验,检测下调LRG1表达后食管鳞癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的变化。3.第三部分:LRG1对食管鳞癌血管生成的影响及相关机制研究。(1)获取食管鳞癌Eca109细胞培养液的上清液,与新鲜培养基等体积混匀,所得混合液用于培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),检测HUVEC细胞成管能力的变化。(2)检测下调LRG1表达后的食管鳞癌Eca109细胞株中血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平,初步探索LRG1影响食管鳞癌血管生成的分子机制。结果:1.第一部分:LRG1在食管鳞癌中高表达,提示临床不良预后。(1)与正常食管组织相比,食管鳞癌组织中LRG1 mRNA和蛋白的表达明显升高(mRNA:0.95±0.37 vs.0.28±0.12,P<0.001;蛋白:LRG1/GAPDH 0.61±0.14 vs.0.30±0.13,P<0.001)。LRG1主要表达于食管鳞癌细胞的细胞质中,且在不同食管鳞癌患者中的表达具有差异。LRG1在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁组织(χ2=41.558,P<0.001)。(2)本课题收集的120例食管鳞癌患者中,77例(64.2%)患者呈现LRG1高表达,且LRG1表达水平与食管鳞癌浸润深度、脉管侵犯显著相关(P<0.001),与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移等无显著相关性。与LRG1低表达食管鳞癌患者相比,LRG1高表达的食管鳞癌患者总生存时间(OS)和无进展生存时间(PFS)明显缩短(P=0.003和0.002)。(3)通过单因素和多因素分析证实,LRG1表达水平是食管鳞癌患者OS(HR=1.586,95%CI:0.976-2.578,P=0.026)和PFS(HR=1.467,95%CI:0.909-2.368,P<0.001)的独立预后因素。2.第二部分:下调LRG1表达,可抑制食管鳞癌细胞增殖和侵袭能力,促进细胞凋亡。(1)RT-PCR结果显示,质粒转染Eca109细胞后,与sh-NC组相比,sh-LRG1-1组中LRG1 mRNA的表达降低了58.3%,sh-LRG1-2组中LRG1 mRNA的表达率下调了55.5%。KYSE150细胞转染下调LRG1表达的质粒后,sh-LRG1-1组和sh-LRG1-2组中LRG1 mRNA的表达分别降低了 54.6%和53.3%。Western blot结果显示,Eca109和KYSE150细胞转染sh-LRG1-1、sh-LRG1-2后,与sh-NC组相比,LRG1蛋白染色条带减弱,且将LRG1条带和GAPDH内参蛋白条带的光密度值进行计算,LRG1在sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组中的表达均明显下调。(2)CCK8结果显示,与sh-NC组相比,转染sh-LRG1-1和sh-LRG1-2的Eca109和KYSE150细胞增殖活力均受到了抑制。Eca109细胞质粒转染72小时后,sh-LRG1-1组和sh-LRG1-2组的细胞生长活力仅为38.0%和34.1%,sh-NC组细胞生长活力为57.2%。KYSE150细胞质粒转染72小时后,sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组、sh-NC组的细胞生长活力分别为33.8%、29.9%和57.8%。而且,在转染后12～72小时间,两组食管鳞癌细胞系的生长活力呈现出良好的时效关系,与sh-NC组相比,有统计学差异(P<0.05)。(3)食管鳞癌细胞经质粒转染并培养14天后,sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组、sh-NC组的克隆集落形成率分别为Eca109细胞:0.26±0.07、0.31土0.03和0.62±0.14;KYSE150细胞:0.28±0.02、0.29±0.06和0.71±0.17。与sh-NC组相比,转染sh-LRG1-1和sh-LRG1-2的Eca109和KYSE150细胞集落形成率明显降低,P<0.01。(4)下调LRG1后,两种食管鳞癌细胞sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组的凋亡率分别为,Eca109细胞:22.8%和21.7%;KYSE150细胞:19.7%和23.4%。而阴性转染对照组中,Eca109细胞和KYSE150细胞的凋亡率仅分别为3.7%、2.5%。LRG1的下调可促进食管鳞癌细胞的凋亡,P<0.01。(5)下调LRG1后,两种食管鳞癌细胞sh-NC组、sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组穿过Tranwell小室的细胞数分别为,Eca109细胞:465.4±28.1、207.2±19.1、189.3±21.0;KYSE150细胞:357.4±38.2、143.7±23.1、156.6±18.2。与阴性对照组相比,LRG1的下调可降低食管鳞癌细胞的侵袭能力,P<0.01。3.第三部分:下调LRG1表达,食管鳞癌血管生成能力受到抑制。(1)HUVECs细胞经Eca109细胞条件培养液培养后,sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组、sh-NC组的平均单个高倍镜野下成管数分别为:29±5.16、23土2.08和42±3.74;总的成管长度分别为:1907±139、1379±102和2994±215。Eca109细胞sh-LRG1-1组和sh-LRG1-2组细胞上清诱导的HUVECs细胞成管能力较对应的sh-NC组内皮细胞成管能力明显下降(P<0.01)。结果提示,下调LRG1表达后,食管鳞癌诱导血管内皮小管形成能力减弱,LRG1可能具有促进食管鳞癌异常血管新生的能力。(2)通过密度值定量分析和内参蛋白GAPDH的校正,结果显示,与sh-NC组相比,Eca109细胞sh-LRG1-1组、sh-LRG1-2组中VEGF的蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:(1)LRG1在食管鳞癌中高表达,与浸润深度、脉管侵犯等临床病理参数显著相关,其高表达明显缩短了患者的总生存时间和无进展生存时间,有望成为食管鳞癌患者临床预后有效的预测因子。(2)下调食管鳞癌细胞中LRG1的表达,可有效降低肿瘤细胞的增殖、侵袭能力,提高凋亡率,表明LRG1在食管鳞状细胞癌的生物学进展中发挥重要作用。(3)下调食管鳞癌细胞中LRG1的表达,可能通过影响肿瘤细胞中VEGF的表达,降低HUVEC的成管能力,抑制食管鳞癌新生血管的形成。