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富士是中国苹果主栽品种,占总栽培面积的65%以上。但富士存在幼树始果期长、花芽难形成、大小年结果等问题,严重制约苹果生产。目前,拉枝作为促进富士花芽形成的重要措施,在生产上已经广泛应用。但是,拉枝调控富士花芽孕育的基因表达网络和调控分子机制尚不清楚。因此,明确富士苹果花芽孕育与拉枝调控的生理分子机制,有利于丰富果树花芽分化基础理论,对苹果成花特性的遗传改良,开发苹果花芽分化调控技术均具有重要理论和实践意义。本文以难成花品种‘长富2号’和易成花品种‘秦冠’为材料,利用RNA-seq技术,全面解析苹果花芽孕育基因表达模式;并结合重测序技术,比较两个品种成花相关基因DNA多态性变异差异;比较系统阐明拉枝调控苹果花芽形成的基因表达模式,以及miRNAs在响应拉枝促进花芽形成和调控果树童期转变的作用机制;结合苹果花芽孕育表达模式及生物信息学,筛选并研究了苹果MdIDD转录因子家族基因功能。取得的主要结果如下:1、构建了‘长富2号’花芽孕育芽RNA-seq文库,分析了差异基因表达模式,测定了芽和叶片碳水化合物含量及其代谢相关酶活性和激素水平。(1)在花芽孕育早期,芽蔗糖含量较高,而淀粉的快速积累,是花芽孕育的必要条件;而蔗糖、淀粉相关基因呈现类似趋势;(2)在花芽孕育前,芽生长素、赤霉素含量越早达到峰值,越有利于成花;在花芽孕育开始期,细胞分裂素越早达到峰值,越有利于启动成花,相关基因表达趋势与之基本一致;(3)芽脱落酸含量及其生物合成和信号转导相关基因的表达呈现逐渐上调的变化,并与淀粉水平及其合成关键基因的表达同步上调。综合上述结果,形成了糖和激素调控苹果花芽孕育的基因网络假设模型。2、利用重测序技术,对难成花品种‘长富2号’和易成花品种‘秦冠’进行全基因组重测序,分析比较了两者全基因组DNA多态性变异差异。(1)在苹果‘长富2号’和‘秦冠’品种中鉴定的SNPs分别为2,771,129和2,262,888个;SVs分别为82,663和63,764个;INDELs分别为1,572,803和1,294,060个。(2)‘长富2号’和‘秦冠’品种23,111和21,400个基因存在171,520和147,090 SNPs;3,431和2,815个基因存在3,963和3,196 SVs;1681和1345个基因存在1834和1451 INDELs。(3)构建了苹果190个成花相关基因的遗传连锁图谱,并分析比较‘长富2号’、‘秦冠’和‘金冠’3个品种在这些成花基因中存在的DNA多态性差异,其与品种成花特异性密切相关。3、构建了拉枝和对照处理‘长富2号’芽RNA-seq文库,筛选并鉴定了响应拉枝处理与糖代谢、激素、逆境响应及成花相关的差异表达基因。(1)拉枝显著提高树体萌芽率、成花率及短枝比例;(2)拉枝改变了树体碳代谢平衡,显著上调糖代谢相关基因表达,加速糖分子信号的传递,诱导花芽形成;(3)拉枝处理显著上调与逆境响应相关激素ABA、ET、SA及JA的合成及信号转导相关基因表达,且WRKY类转录因子及R基因的表达呈现上调变化;(4)拉枝处理显著上调成花相关基因的表达。4、构建了拉枝处理和对照‘长富2号’花芽孕育miRNA文库,筛选并鉴定了差异表达的miRNAs。(1)获得39个已知miRNAs家族的188个miRNAs和137个novel miRNAs;有68和27个已知miRNAs分别下调和上调表达,37个novel miRNAs差异表达。(2)与激素相关的miR396、160、159、319和164,以及靶基因GRFs、ARFs、MYBs、TCP4和NAC1显著差异表达。(3)一些成花关键基因(SPLs、SOC1、FT、AFL1和AP1)显著上调表达。综合分析,提出了与激素相关的miRNAs介导拉枝促进花芽形成的分子调控模型。5、构建了平邑甜茶成年期和童期叶片miRNA和降解组文库,鉴定两者差异表达的已知miRNAs和novel miRNAs,并分析其靶基因的生物学功能和表达模式。(1)获得了42个已知miRNAs家族和172个novel miRNAs;(2)鉴定了25个已知miRNAs的127个靶基因和35个novel miRNAs的168个靶基因;(3)明确了miR156-SPLs、miR172-AP2和生长素相关的miR160和miR393及其靶基因协同调控果树童期阶段转变的网络模式。6、鉴定获得了20个苹果MdIDD基因家族成员,发现均含有4个高度保守的锌指类结构域,分别为ZF1(CCHH)、ZF1(CCHH)、ZF1(CCHC)和ZF1(CCHC)。(1)采用qRT-PCR,检测了‘长富2号’及其蔗糖处理和‘烟富6号’品种芽在花芽孕育过程中,10个关键MdIDD基因的表达模式。‘烟富6号’芽10个关键MdIDD家族基因表达水平均显著高于‘长富2号’,而‘长富2号’芽有8个MdIDD家族基因响应蔗糖处理上调表达。(2)克隆获得7个MdIDD基因cDNA全长序列;(3)在拟南芥野生型过量表达了苹果MdIDD2基因。