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4-羟基肉桂醛和4-羟基肉桂醇是植物木质素通过苯丙烷类代谢途径生物合成过程的中间代谢物,它们不仅具有生物学研究价值,还有重要的经济和医药价值。然而,从植物中直接提取这些自然资源具有一定局限性,如较长的生长周期,易受环境因素影响等。化学合成法往往操作步骤繁琐,副产物多,容易污染环境。因此,研究和开发4-羟基肉桂醛与4-羟基肉桂醇类化合物的微生物合成方法具有重要理论意义和实践价值。本论文旨在为4-羟基肉桂醛和4-羟基肉桂醇类化合物的合成提供一条行之有效的新途径。研究结果总结为如下四个部分:(1)利用基因工程技术,构建了 4种能够将苯丙酸转化成4-羟基肉桂醛的工程菌,分别为大肠杆菌 M15-4CL1+M15-CCR,M15-4CL1-CCR,BL21-4CL1+CCR 和BL21-4CL1-CCR。通过SDS-PAGE技术检测,确认重组酶都能在工程菌中高效表达。以转化香豆酸为例,比较了这4种工程菌的生物转化能力,结果表明能够高效表达人工融合双功能酶的大肠杆菌M15-4CL1-CCR为最适转化菌株,它保留了 4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL1)和肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的催化功能,不仅解决了中间代谢产物不能自由透过细胞膜的问题,而且具有更高的催化活性。(2)建立了基于HPLC-PDA-ESI-MSn分离鉴定多种苯丙酸(香豆酸、咖啡酸和阿魏酸)、4-羟基肉桂醛(香豆醛、咖啡醛、松柏醛和芥子醛)和4-羟基肉桂醇(香豆醇、咖啡醇和松柏醇)的方法,包括用乙酸乙酯粗提取,SPE固相萃取柱纯化,通过HPLC系统分离,以及使用ESI-MSn系统进一步鉴定。(3)利用大肠杆菌M15-4CL1-CCR作为全细胞生物催化剂,进一步以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸三种苯丙酸为底物开展生物转化试验。经HPLC-PDA-ESI-MSn鉴定,证明所得转化产物分别为香豆醛、咖啡醛和松柏醛。通过定量分析,计算得到苯丙酸的转化率以及4-羟基肉桂醛的得率,其中香豆酸是最有效的酰基供体,生物转化得到的产物最多,香豆醛、咖啡醛和松柏醛的得率分别为34%,11%和19%。(4)采用固定化细胞技术,制备了大肠杆菌M15-4CL1-CCR和M15-CAD固定化细胞生物催化剂,直接以廉价苯丙酸为底物,借助微生物细胞内的再生的辅因子,在一个体系中完成三步酶催化反应,实现从苯丙酸到4-羟基肉桂醇的连续生产。分别以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸为底物开展生物转化试验,经HPLC-PDA-ESI-MSn鉴定,证明所得转化产物为目标产物4-羟基肉桂醇。通过对该固定化细胞体系的转化条件进行优化,得到了最佳转化条件:最适温度为30℃,反应体系pH为7.0,转化时间为6～8 h。在此条件下,香豆醇、咖啡醇和松柏醇的得率分别可达58%,24%和60%。微生物转化法作为一种新型的绿色合成手段,具有简单,高效,经济和环保的特点,对天然活性成分的合成有着不可替代的作用。将融合酶技术应用于微生物转化的研究中,不仅可以解决中间代谢产物不能自由透过细胞膜的问题,同时提高了催化效率。本研究利用全细胞融合双功能酶4CL1-CCR生物催化剂合成了植物天然产物4-羟基肉桂醛和4-羟基肉桂醇,摸索出了一条生产4-羟基肉桂醛和4-羟基肉桂醇类化合物的新途径,为其生物合成工艺的开发奠定了理论基础,也为以后其它天然产物的合成提供了新的思路。