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目的: 骨肉瘤中lncRNA和mRNA的调控机制尚不清楚,本研究利用微矩阵基因芯片技术研究骨肉瘤和癌旁组织中基因表达谱的差异,并对差异信号通路和基因进行研究和验证。重楼是“芪珍胶囊”组成药物之一,其有效成分重楼皂苷Ⅰ(PPⅠ)抑制骨肉瘤的分子机制尚不明确,本研究将结合芯片结果,探索重楼皂苷Ⅰ体外抑制骨肉瘤的作用机制。 方法: 1.提取5例患者骨肉瘤和癌旁组织总RNA,进行质量测定,合格后进行芯片杂交,经过Arraystar基因芯片扫描仪扫描后得到原始数据,原始数据经过转换后进行统计分析,设定差异表达筛选标准Fold Change≥2.0、P<0.05,得到两种组织之间lncRNA和mRNA的差异表达谱; 2.筛选结果中差异表达9个lncRNA:BC037891、RP1-15D23.2、RP13-131K19.1、DDX11-AS1、 SNHG6、RP11-702F3.3、 BC062769、 BRE-AS1、RP11-618G20.2,采用实时荧光定量聚合酶链反应(Realtime PCR)技术验证与芯片检测结果的一致性; 3.综合NCBI Refseq、UCSC、RNAdb、LncRNAs等数据库资源,对芯片结果进行Gene Ontology、 K EGG Pathways分析等初步生物信息学分析,并建立lncRNA与靶基因的基因网络图; 4.PPⅠ体外抑制骨肉瘤的机制研究:用Countstar细胞计数仪、实时细胞分析系统检测不同浓度PPⅠ与骨肉瘤细胞株(MG-63、U-2OS、Saos-2)共培养不同时间后骨肉瘤细胞的存活率;实时细胞分析系统检测PPⅠ对骨肉瘤细胞迁移能力的影响;用实时细胞分析系统检测PPⅠ对骨肉瘤细胞浸润能力的影响;用流式细胞术检测不同浓度PPⅠ对骨肉瘤细胞凋亡率和细胞周期的影响。用Realtime PCR、Western Blot分别检测骨肉瘤相关信号通路基因转录和的关键蛋白表达影响。 结果: 1.获取骨肉瘤组织与癌旁组织基因差异表达谱,共计有5399个lncRNA呈表达差异,有2077个lncRNA表达上调,上调倍数最大的是PDLIM3(FoldChange:64.669384);3322个lncRNA表达下调,下调倍数最大的是CTC-340A15.2(Fold Change:28.4717302)。同时检测到3703个mRNA呈表达差异,其中2289个mRNA表达上调,上调倍数最大的是TTN(Fold Change:110.3665978),1414个mRNA表达下调,下调倍数最大的是DEF A4(Fold Change:55.9800605); 2.Realtime PCR检测骨肉瘤组织和癌旁组织中9个lncRNAs的表达与芯片检测结果的一致性。芯片检测表达下调的BC037891、RP1-15D23.2、RP13-131K19.1、DDX11-AS1,Realtime PCR验证同样为表达下调;芯片检测上调的SNHG6,Realtime PCR验证同样为表达上调,共计5个lncRNA表达是一致的。但lncRNA芯片检测表达下调的RP11-702F3.3、表达下调的BC062769、BRE-AS1,芯片检测上调的RP11-618G20.2与实时荧光定量PCR结果并不一致,两种方法的检测效能有待进一步提高; 3.GO分析显示上调表达mRNA基因中有1137个基因富集于生物学进程,下调表达mRNA有568个富集于生物学进程;上调表达的mRNA基因中有173个富集于细胞组分,下调表达的mRNA基因有72个富集于细胞组分;上调表达mRNA基因中有156个基因富集于分子功能,下调表达mRNA有121个富集于生物学分子功能。KEGG Pathway分析显示,有64条信号通路与上调表达的mRNA相关,有14条与下调表达的mRNA相关; 4.重楼皂苷Ⅰ(PPⅠ)呈时间和浓度依赖性诱导人骨肉瘤细胞凋亡,诱发细胞周期阻滞,阻止NF-κB核转运,抑制人骨肉瘤细胞中NF-κB信号通路活性,并通过增强ER应激上调人骨肉瘤细胞UPR信号通路表达,抑制人骨肉瘤细胞存活、增殖、细胞迁移和浸润能力,综合发挥抑制骨肉瘤作用; 5.DDX11-AS1可能是一种潜在的骨肉瘤抑癌基因候选标记物。 结论: 1.芯片检测是筛选骨肉瘤组织与癌旁组织差异表达基因一种有效方法; 2.较早利用lncRNA基因芯片揭示在骨肉瘤中存在异常表达的lncRNA,实时荧光定量PCR验证芯片结果,提高了结果的可信度,生物信息学初步分析显示这些lncRNA在骨肉瘤的发生发展中发挥复杂的调控作用; 3.重楼皂苷Ⅰ(PPⅠ)呈时间和浓度依赖性诱导人骨肉瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞,阻止NF-κB核转运,抑制人骨肉瘤细胞中NF-κB信号通路活性,并通过增强ER应激上调人骨肉瘤细胞UPR信号通路表达,抑制人骨肉瘤细胞存活、增殖、细胞迁移和浸润能力,综合发挥抑制骨肉瘤作用。