重度烧伤急救与治疗一直是临床和实验研究的重点和难点,伤后免疫功能的紊乱,不但可以促发全身性炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),而且还是多器官功能障碍(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)及患者死亡的主要诱因。巨噬细胞在整个烧伤炎症及损伤修复过程中均有重要的作用,是机体抗感染免疫的最主要效应细胞之一,同时也是机体内环境中免疫细胞和免疫分子致伤后免疫系统发生紊乱的重要细胞。目前关于调控巨噬细胞的免疫反应来控制伤后机体失控性炎症反应尚存不明确,因此从巨噬细胞免疫调节作用角度来救治重度烧伤是一个重要的解决思路。Notch分子首次发现于1917年的摩尔根实验室,因其突变能够造成果蝇翅膀边缘出现小缺口(Notches)而得名。目前已知,Notch分子信号家族成员具有高度的结构同源性及保守性,其受体及配体属于Ⅰ型膜蛋白,对哺乳动物而言Notch受体有4种(Notch 1、Notch 2、Notch3和Notch4),表达在多种组织和器官中。Notch配体分为Delta-like(Delta-like1,Delta-like3,Delta-like4)和Jagged(Jagged1,Jagged2)两类。Notch分子信号通路功能广泛,可以调控机体多种免疫细胞的发育及功能,而且可以通过多种分子机制调控单核-巨噬细胞系统的激活和功能。因此我们假设,notch分子信号通路在重度烧伤后存在表达上的变化并且对机体免疫反应应答发挥重要作用,本研究拟探讨其作用及分子机制。方法:1.课题实验研究第一部分建立稳定的c57/bl6j小鼠30%体表总面积(totalbodysurfacearea,tbsa)Ⅲ度烫伤模型,观察并评定创面深度,伤后依据不同时间点检测创面周围notch分子表达量;探讨重度烧伤情况下notch信号变化趋势。2.课题实验研究第二部分体外模拟重度烧伤后内环境,培养raw264.7巨噬细胞系,经不同烧伤血清刺激巨噬细胞,检测其notch信号表达改变;实验分假伤血清组和烧伤血清组,烧伤血清组可分为烧伤后6h、12h、24h、48h及4d、7d血清组。各组血清与rpmi-1640培养液制成20%的混合培养液,培养巨噬细胞,分别于0h、4h、8h、12h、24h、48h收集细胞样品,检测其notch1分子表达量。3.课题实验研究第三部分基本探讨重度烧伤后巨噬细胞notch信号通路激活的分子机制,并研究notch信号通路激活后对其分泌功能的影响。使用重度烧伤后24h及7d收集的血清刺激巨噬细胞,同时用假伤大鼠血清加脂多糖(lipopolysaccharide,lps)制成混合培养液刺激巨噬细胞,比较notch信号通路变化的异同;另外收集上述各组细胞培养上清液,检测巨噬细胞的分泌功能,elisa酶联反应试剂盒检测各组细胞培养上清液中il-6和tnf-α含量。结果:1.实验第一部分利用c57/bl6j小鼠建立稳定的30%tbsaⅢ度烫伤模型,伤后免疫组化染色结果显示:烧伤Ⅲ度12h及24h后notch1信号表达均明显高于对照组;而notch2分子表达量增高不明显;创周组织蛋白质免疫印迹结果显示:重度烧伤后创周组织中存在notch1和notch2分子的表达增高。2.实验第二部分体外模拟重度烧伤后内环境,培养利用raw264.7巨噬细胞系,经不同组重度烧伤血清刺激后,各组巨噬细胞中notch信号表达量有明显差异;其结果显示:利用早期重度烧伤血清制成混合培养液,培养巨噬细胞一定时间后,notch1分子表达量趋势总体升高,并且随着刺激时间延长而达到高峰;而采用重度烧伤后期的血清制成混合培养液,培养巨噬细胞相同时间后,对notch1信号的激活作用减弱。3.实验第三部分基本探讨重度烧伤后巨噬细胞notch信号通路激活的分子机制,并研究Notch 1信号通路激活后对其分泌功能的影响;研究结果表明重度烧伤巨噬细胞激活途径与LPS激活Notch信号机制相似,并且烧伤24 h血清、假伤血清+LPS刺激后培养上清液中炎症因子IL-6、TNF-α的含量明显增加,说明Notch信号激活后能够明显增强巨噬细胞的分泌功能。结论:Ⅲ度烫伤情况下创周存在Notch分子高表达;早期重度烧伤血清刺激下巨噬细胞Notch信号被激活,同时伴有IL-6及TNF-α分泌能力增强,且这现象的机制可能与LPS激活巨噬细胞Notch信号相似。