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子宫内膜癌是最常见的妇科生殖系统恶性肿瘤之一,在发达国家,发病率居女性生殖道恶性肿瘤首位,死亡率居第二位,高发年龄为50～61岁。近年来,由于环境、生活方式等因素的共同影响,子宫内膜癌发病呈现年轻化趋势。目前,子宫内膜癌的发病机制仍不十分清楚,大家广泛认可的相关因素有:长期持续的雌激素刺激,患者自身体质原因如肥胖、糖尿病、高血压、不孕或绝经延迟,遗传因素。子宫内膜癌的发生是一个复杂的、伴随许多分子生物学改变的多因素共同作用的结果。随着人类基因组测序工程的顺利完成,近年来从分子层面研究子宫内膜癌基因改变成为研究的热点。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下,将甲基基团转移到胞嘧啶环的第5位碳原子上,是目前已知的哺乳动物唯一的自然化学修饰方式,其本质是在不改变DNA碱基序列的前提下,对DNA进行化学修饰,从而影响基因下游产物表达,最终导致肿瘤的发生。DNA甲基化多发生在CpG岛位点,CpG岛是长度>200bp,C+G的含量≥50%的DNA序列,多位于基因的启动子区域。正常细胞的CpG岛处于非甲基化状态,当抑癌基因启动子区CpG岛发生甲基化时,导致基因表达沉默,抑癌功能丧失。越来越多的研究证明,肿瘤组织中存在抑癌基因的高甲基化状态及表达产物减少或缺失,DNA启动子甲基化是肿瘤发生、发展的重要机制之一。Ras相关区域家族1A基因(Ras associated domain family 1A , RASSF1A)是2000年发现的一种新型抑癌基因,其cDNA编码产物是分子量为38800的蛋白多肽,RASSF1A蛋白在正常组织中100%表达,参与细胞周期调控,通过多种途径抑制细胞的过度生长、分化,促进细胞衰老、凋亡。当发生基因启动子甲基化时,可能使编码产物RASSF1A蛋白表达减少或缺失,抑制细胞过度增殖的作用消失,最终导致肿瘤发生。目的:关于RASSF1A基因甲基化与子宫内膜癌关系的研究在国内鲜有报道,本文旨在通过MSP法检测子宫内膜癌中RASSF1A基因启动子区甲基化状态及RASSF1A蛋白表达情况,揭示RASSF1A基因甲基化与子宫内膜癌的发生、发展的关系。方法:收集2008—2010年河北医科大学第三医院、第四医院手术切除经病理证实的子宫内膜癌标本40例(患者术前均未行放、化疗),同时选取行全子宫切除正常增生期子宫内膜40例(患者术前无异常子宫出血,半年内未行激素治疗)。新鲜标本取出后立即置入-80℃冰箱保存,以备提取组织DNA,同时取部分新鲜组织标本经10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋,4μm连续切片,供免疫组织化学试验所用。应用甲基化特异性PCR(MSP)检测RASSF1A基因启动子甲基化状态,MSP的基本原理:模板DNA经NAOH变性形成单链,经亚硫酸氢钠修饰后,甲基化的DNA胞嘧啶保持不变,未甲基化的DNA胞嘧啶转化成尿嘧啶,利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠脱氨基变成尿嘧啶的原理,设计甲基化与非甲基引物,进行PCR扩增,以此检测甲基化状态。通过检测子宫内膜癌与正常子宫内膜中RASSF1A基因启动子区甲基化状态,比较两组之间甲基化率的差异。采用免疫组织化学方法检测子宫内膜癌及正常子宫内膜RASSF1A蛋白表达情况:甲醛溶液固定的内膜组织经过洗涤脱水和石蜡包埋,4μm连续切片。RASSF1A蛋白免疫组化染色后表达在细胞浆,为棕黄色颗粒,呈弥漫性分布,尤以腺体处表达最为明显。阳性表达判定标准:在高倍镜视野下(×400),随机选取5个视野,每个视野细胞数不少于100,分别计算阳性细胞百分比及细胞染色强度,并予以评分:评分阳性细胞数染色深度0分<5%无色1分5～25%淡黄色2分26～50%黄色3分51～75%棕褐色4分>75% RASSF1A蛋白阳性表达=阳性细胞百分比×染色深度: 0～2分阴性(-) 3～8分阳性(+) 9～12分强阳性(+ +)结果:1 RASSF1A基因甲基化状态:40例子宫内膜癌中,27例癌组织存在RASSF1A基因启动子甲基化,甲基化频率67.5%(27/40);40例正常子宫内膜,5例组织存在RASSF1A基因启动子甲基化,甲基化频率12.5%(5/40)。子宫内膜癌RASSF1A基因启动子甲基化率明显高于正常子宫内膜,两组比较差异有统计学意义(χ~2=25.208,P=0.000<0.01)。2 RASSF1A蛋白表达情况:40例子宫内膜癌中,17例RASSF1A蛋白表达阳性,表达率42.5%(17/40);40例正常子宫内膜RASSF1A蛋白阳性表达100%(40/40)。子宫内膜癌中RASSF1A蛋白阳性表达率明显低于正常子宫内膜,差异有统计学意义(χ~2=32.281,P=0.000<0.01)。结论:子宫内膜癌组织中,存在RASSF1A基因高甲基化及RASSF1A蛋白显著低表达或缺失,由此可以推断:1 RASSF1A基因启动子甲基化可能造成该基因失活的原因,表达产物减少或缺失与基因甲基化密切相关。2 RASSF1A基因启动子甲基化可能是子宫内膜癌的发病机制之一, RASSF1A蛋白表达减少或缺失对子宫内膜癌的发生、发展起了重要作用。3 RASSF1A有望成为子宫内膜癌的分子标志物,从而为子宫内膜癌的早期诊断及生物靶向治疗提供理论依据。