H₂O₂是植物细胞的可移动的信号分子，是植物细胞代谢的正常产物，各种生物和非生物胁迫能促使植物细胞产生过量H₂O₂，并通过H₂O₂信号转导响应环境胁迫。H₂O₂信号调控一系列重要的植物生理生化过程和基因表达，如系统获得抗性（SAR）和高度敏感抗性（HR），细胞衰老与程序化死亡（PCD），气孔关闭，根的向地性、根和侧根的生长，细胞壁的发育，柱头与花粉粒间的关系等。Ca²⁺流动和可逆蛋白磷酸化作用是H₂O₂信号途径的下游信号，通过MAPK级联作用于转录因子，最终调控基因的表达。已经发现H₂O₂调控多种基因的表达，包括编码抗氧化酶基因和调控H₂O₂产生的蛋白，以及过氧物酶体生物发生所需要的蛋白。虽然近年来对H₂O₂信号及其功能的研究取得了一系列重要进展，但关于H₂O₂在植物不定根形成与发育过程中的信号作用的研究还未见文献报道。不定根是指从茎、叶和老根的非中柱鞘组织产生的根，是植物无性繁殖的重要途径之一，普遍存在于被子植物和裸子植物界。各种外部环境的和内部的因子调控不定根的发生，已经发现的内部调控因子有矿质营养元素、糖、酚类、乙烯、多胺、NO、H₂O₂、CO、cGMP、MAPKs、植物激素和过氧化物酶等，其中生长素信号对不定根的形成起着关键作用，Ca²⁺、乙烯、NO、H₂O₂、CO、cGMP、MAPK等可能都是生长素信号途径中的信使分子，参与了生长素诱导的不定根形成的信号途径，并最终调控生长素响应基因和不定根响应基因的表达。近年来，对生长素和不定根响应信号的研究受到广泛关注，并取得了许多重要成果，如发现NO是生长素诱导的不定根形成的信号分子，在不定根的诱导中IAA可能是通过NO而起作用的，cGMP和MAPK级联是NO信号途径的下游分子。那么，在不定根的诱导中，与NO性质相似的H₂O₂是否也具有与NO相同的信号作用，正是本文需要研究的问题。本文基于当前的研究进展，运用形态学、生理学和生物化学的研究方法，以绿豆（Mucuna pruriens（Linn．）DC．var．utilis）为研究材料，研究了H₂O₂在不定根形成与发育中的作用、信号转导及其可能的生理生化机理。本文取得的主要结果与结论如下。1．外源H₂O₂具有促进绿豆幼苗外植体不定根形成与生长的作用。用1-100mMH₂O₂处理8-18h能显著促进不定根的形成与生长，H₂O₂清除剂CAT和ASA能去除外源H₂O₂对不定根形成和生长的促进作用。CAT是H₂O₂的敏感的清除剂，外源CAT对不定根的形成和生长没有显著影响，但外源100 U CAT和H₂O₂一同处理时，外源H₂O₂对不定根的促进作用被CAT去除；H₂O₂是ASA最重要的降解底物，4 mM ASA与H₂O₂一同处理时，外源H₂O₂对不定根的促进作用被ASA去除。2．H₂O₂是生长素诱导的绿豆幼苗外植体不定根形成过程中的信号分子。TIBA通过抑制IAA向茎基部的极性运输而强烈抑制不定根的形成，大于1μM的TIBA强烈抑制绿豆幼苗外植体不定根的形成，而TIBA对不定根形成的抑制作用能被IAA部分地逆转，同时也能被H₂O₂部分地逆转，这说明IAA诱导绿豆不定根的形成可能是通过H₂O₂而起作用。3．H₂O₂可能作为生长素的下游信号，参与生长素诱导的不定根形成的信号转导。DPI专一性抑制细胞内NADPH途径的H₂O₂的产生，发现10μM DPI处理48 h能强烈抑制绿豆不定根的形成，而H₂O₂和IBA能够部分地逆转DPI的抑制作用，这说明当NADPH氧化酶途径的内源H₂O₂的产生被抑制后，不定根的形成同时被抑制，证明H₂O₂可能参与了IBA诱导的不定根形成的信号过程。4．H₂O₂可能只是生长素诱导的不定根形成过程中的下游信号之一。CAT与IBA一同处理时，CAT不能去除IBA对不定根的促进作用，是由于CAT是非细胞透过的，所以对内源H₂O₂没有清除作用；由于ASA是细胞透过的，外源ASA能够清除细胞内的H₂O₂，ASA能够去除外源H₂O₂诱导的不定根数量的增加，但对IBA诱导的不定根形成没有明显去除作用，这可能说明，H₂O₂只是生长素响应的不定根形成信号网络中的成员之一。5．IBA处理能够显著促进绿豆幼苗外植体细胞内H₂O₂的产生。在初生根切除后3 h时，与H₂O处理相比较，IBA处理显著增加H₂O₂的浓度，这说明IBA诱导H₂O₂的产生，暗示IBA对不定根形成的诱导作用可能是通过H₂O₂实现的。6．H₂O₂和NO可能是生长素信号途径中两个平行的下游信号分子。已知NO是IAA诱导的不定根形成过程中的信号分子，但当用DPI抑制H₂O₂的产生，不仅抑制H₂O₂对不定根的诱导作用，而且NO诱导的不定根的形成作用也被抑制。这可能暗示H₂O₂和NO都是生长素信号途径的下游分子，而且H₂O₂可能位于NO的下游。7．Ca²⁺可能是H₂O₂下游信号分子。胞外Ca²⁺螯合剂EDTA（1 mM）对绿豆幼苗外植体不定根的形成没有显著地抑制作用，而胞内Ca²⁺释放抑制剂钌红（10μM）则完全抑制了不定根的形成，且这种抑制作用不能被H₂O₂和IBA去除，钌红（10μM）也完全抑制H₂O₂和IBA对不定根形成的诱导作用，这说明Ca²⁺的流动是不定根形成所需要的，且Ca²⁺可能是H₂O₂下游信号分子。8．cGMP可能是H₂O₂信号途径的下游成员。GMP环化酶专一性抑制剂LY83583（20μM）对绿豆幼苗外植体不定根的形成与生长有显著抑制作用，LY83583与cGMP类似物8-Br-cGMP、H₂O₂或IBA共同处理时，8-Br-cGMP、H₂O₂和IBA能部分逆转LY83583的抑制作用，这说明H₂O₂和IBA可能促进cGMP的合成，进而促进不定根的形成，cGMP可能是H₂O₂信号途径的下游成员。9．MAPK级联参与了生长素响应的植物不定根信号途径，且MAPK信号级联位于H₂O₂信号的下游。MAPKK专一性抑制剂PD98059（30μM）完全抑制绿豆幼苗外植体不定根的形成，PD98059也完全抑制H₂O₂和IBA诱导的不定根的形成，表明，MAPK级联参与了生长素响应的植物不定根信号途径，且MAPK信号级联位于H₂O₂信号的下游。10．与IBA的作用机理相似，H₂O₂和IBA处理都能显著降低不定根诱导阶段POD的活性，与这一时段需要较高的IAA浓度相关，而较高的IAA浓度可能在于促进H₂O₂的产生，启动H₂O₂信号转导。在绿豆幼苗外植体不定根形成的0 h-48 h内，POD活性的变化基本遵循降—升—降—升的规律，当用H₂O₂和IBA处理后3 h时，POD活性显著降低，在3 h-36 h之间，POD活性发生升降的变化，而在36 h后，POD活性升高，这一时段要求较低的IAA浓度以保证不定根原基的长出，较高的POD活性促进内源IAA的分解，降低了内源IAA的浓度，可能也在于降低H₂O₂的浓度。11．在绿豆幼苗外植体不定根形成的0 h-48 h阶段，CAT活性保持在一个相对稳定的水平，仅有比较小的变化，而这些变化基本没有统计学意义，这可能暗示，在不定根的诱导与根原基的形成阶段，CAT对细胞内H₂O₂浓度的变化不如POD敏感。12．H₂O₂和IBA处理都能显著降低不定根诱导阶段APX的活性，APX活性的变化规律与POD活性的变化极其相似，在不定根的形成过程中，APX与POD活性的变化具有同等意义，进一步说明H₂O₂与IBA的作用机理相同。IBA和H₂O₂处理，在0 h-3 h时间段降低APX活性，在36 h-48 h时间段升高APX活性，APX活性在48 h时均达到峰值。综上，我们认为H₂O₂在绿豆幼苗外植体不定根形成过程中，起信号分子的作用，能够促进不定根形成与生长，生长素对不定根形成的诱导作用可能是通过H₂O₂而起作用的，H₂O₂和NO可能是生长素信号途径中的两个平行的下游分子，且H₂O₂可能位于NO的下游，Ca²⁺、cGMP和MAPK级联都是H₂O₂信号途径的下游分子，共同组成生长素信号网络。H₂O₂和IBA对POD、CAT和APX活性的影响，反映出它们在不定根形成过程中具有相同的作用机理。