柑橘大实蝇Bactrocera minax作为柑橘类果树上的重要害虫,其成虫将卵产于柑橘果实内,幼虫在果实中钻蛀取食,严重影响了柑橘的产量和质量。由于柑橘大实蝇幼虫钻蛀危害,使得化学防治效果较差,所以人们将防控重点放在柑橘大实蝇成虫的防控上。利用嗅觉诱捕害虫是一个高效、环保的防治策略。鉴于此,深入研究柑橘大实蝇的嗅觉识别机制,既可以加深对柑橘大实蝇嗅觉识别通路的认知,也为研制高效引诱剂或驱避剂提供理论依据。非典型气味受体（odorant receptor co-receptor,Orco）是昆虫嗅觉通路中的关键蛋白。Orco常与特异性气味受体ORx以异源二聚体的形式作为昆虫嗅觉信号转导过程中的功能蛋白,促使化学信号转导为电信号,传入昆虫中枢神经。化学感受蛋白（chemosensory proteins,CSPs）也是昆虫的嗅觉识别过程的重要蛋白,它可以结合并运输脂溶性的气味分子穿过感受器淋巴液至嗅觉受体,进而引发昆虫相应的嗅觉行为。昆虫非典型气味受体和化学感受蛋白是害虫防治的潜在靶标,针对这一靶标有助于研发绿色防治策略。本课题通过柑橘大实蝇头部转录组分析,获得1个Orco基因（BminOrco）和4个CSP基因（BminCSP1-BminCSP4）,并对这些基因的生物信息学和组织表达模式进行了分析。根据组织表达模式结果,将在触角中高表达的BminCSP3进行了原核表达、蛋白纯化,得到该基因的异源表达蛋白。利用荧光竞争结合实验,分析了BminCSP3与14种气味化合物的结合特性。主要研究结果如下:1.BminOrco和BminCSPs序列分析柑橘大实蝇Orco基因（BminOrco）开放阅读框全长1431 bp,编码476个氨基酸,含有7个跨膜结构域,氨基端位于膜内,羧基端位于膜外;预测该蛋白等电点为8.69,分子质量53.41 ku,无信号肽,亲水性总平均值为0.296,是疏水蛋白。同源性比对和系统树分析结果显示,BminOrco氨基酸序列与鞘翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和直翅目昆虫均具有很高的同源性,其中与黑腹果蝇Drosophila melanogaster的Dmel Orco同源性最高,达到86.42%。柑橘大实蝇4个CSP基因（BminCSP1-BminCSP4）开放阅读框由336-474bp组成,编码111-157个氨基酸残基。预测4个BminCSP的成熟蛋白（去掉氨基端信号肽的蛋白）分子量为9616-14901 Da,等电点为5.19-9.46。同时,这4个BminCSPs多肽链中都具有CSP家族典型特征:即4个保守半胱氨酸残基。系统进化树表明,双翅目昆虫CSP基因可能来自于3个祖先基因,随后由于不同的选择压力产生了相应分化。4个BminCSPs分化明显,它们分别聚类于不同的进化分支上,说明它们可能具有不同的功能。2.BminOrco和BminCSPs组织表达分析通过荧光实时定量PCR分析了BminOrco和BminCSP1-BminCSP4在柑橘大实蝇雌雄成虫不同组织中的分布情况。结果发现,BminOrco在成虫触角中的相对表达量显著高于其他组织的表达量,在头部（不含触角）、胸、腹、足和翅中微量表达,暗示BminOrco在柑橘大实蝇嗅觉识别扮演重要角色;而BminCSPs的情况则不同:BminCSP3在触角中显著上调表达,BminCSP4在头部组织（不含触角）中显著上调表达,而BminCSP1和BminCSP2表达的部位比较广泛,除触角组织中高表达外,在足、翅膀、腹部和胸部中也有较高的表达量。BminCSPs组织表达模式进一步说明不同的BminCSPs很可能具有不同的生理功能。3.BminCSP3基因克隆、原核表达和蛋白纯化为了验证在触角中高表达的BminCSP3的嗅觉功能,成功构建了BminCSP3基因的克隆载体（p GEM-T/BminCSP3）和原核表达载体（p ET-32a/BminCSP3）,经过在大肠杆菌BL21（ED3）中诱导表达、重组蛋白纯化、肠激酶切除重组蛋白的His标签,最终得到纯度较高的目的蛋白BminCSP3。4.BminCSP3的结合特性分析使用荧光探针1-NPN,通过荧光竞争结合方法分析了BminCSP3与14种气味配体的亲和性。本实验中所选用的气味配体大部分能够引起柑橘大实蝇成虫的行为反应。荧光竞争实验结果显示,BminCSP3与供试14种气味配体的Ki值均大于20μM,一般认为Ki值大于20μM,蛋白与配体分子间的亲和力较弱。说明BminCSP3虽然在柑橘大实蝇成虫触角中显著上调表达,但可能不参与柑橘大实蝇成虫的嗅觉识别过程。由此推测,气味结合蛋白（OBPs）在柑橘大实蝇成虫与外界气味发生的第一步生化过程中发挥着主要功能,而非化学感受蛋白（CSPs）。