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恶性肿瘤是目前严重威胁人类生命健康的头号疾病。表观遗传学在恶性肿瘤发生和发展的作用以及围绕其相关调控靶点的药物研发，已经成为抗肿瘤药物研发过程中的一个重要领域和分支。而在表观遗传学的众多成员中，组蛋白修饰无疑是最为热门的研究方向之一，组蛋白修饰在转录调控、基因组完整性和染色体稳定性方面发挥着重要作用。作为组蛋白赖氨酸去甲基化酶中重要一员，组蛋白赖氨酸去甲基化酶5B（Histone Lysine Demethylase5B,以下简称KDM5B）是2007年被发现的一种Fe2+和α-OG（2-酮戊二酸）依赖性的去甲基化酶，可特异性的去除组蛋白赖氨酸的二、三甲基化（H3K4me2/3）。近期众多研究表明KDM5B的表达量在多种肿瘤细胞（乳腺癌、前列腺癌、胃癌等）中显著高于相应的正常细胞，且与肿瘤的发生、发展，以及耐药的产生都存在着密切联系，故研究开发特异性靶向KDM5B的小分子抑制剂，对开展肿瘤治疗的研究与药物开发具有重大的科学意义和实际应用价值。
本文以高通量虚拟筛选出来的苗头化合物为先导，综合运用多种药物设计策略设计合成了吡唑类和吡唑[3,4-b]并吡啶类两个系列衍生物，并从蛋白水平、细胞水平和动物水平评价了其KDM5B抑制活性和抗肿瘤活性。具体研究工作如下：
一、通过计算机辅助药物设计技术分析研究已报道的KDM5B共晶复合物的结构并创建了药效团，以KDM5B蛋白结构为受体对200万个小分子化合物进行多轮的筛选，并从中挑选出了20个打分较高且与KDM5B活性口袋结合良好的苗头化合物。随后通过课题组自建的KDM5B抑制活性评价方法的检测发现了多个具有KDM5B抑制活性的化合物，其中化合物A8和A13抑制活性IC50分别为9.3201μM和4.5572μM。分别以A8和A13为先导化合物，综合运用基于蛋白结构药物设计方法、骨架迁移、生物电子等排等多种药物设计策略设计合成了吡唑类和吡唑[3,4-b]并吡啶类两个系列共计151个结构新颖的化合物，所有合成的化合物均通过NMR和MS等波谱学方法进行了表征确证。
二、使用课题组建立的KDM5B抑制活性评价方法对79个吡唑类衍生物（系列Ⅰ）进行了蛋白水平的活性评价，结果表明吡唑类衍生物是一类高效的KDM5B抑制剂，其中有16个化合物的IC50优于300nM，以化合物48ba的IC50（24.4nM）为最佳。并且通过同源蛋白的选择性研究发现化合物48ba具有良好酶水平选择性，化合物48ba对KDM4A、KDM4C和KDM6A的IC50仅有1μM左右。通过分子对接和构效关系研究发现吡唑环骨架是该系列化合物具有KDM5B抑制活性的必须基团，且吡唑环的1位（R2）和3位（R1）引入疏水基团有利于活性的增加，化合物分子中的胺基片段（R3）以亲水基团为宜，尤其以含有相距三个单键的双N原子的链为最佳。此外，以KDM5B高表达的胃癌细胞MKN45做为受试细胞并对部分IC50优于200nM的吡唑类KDM5B抑制剂进行了细胞水平的活性评价，结果表明化合物48ba与阳性对照物CPI-455具有类似的胃癌细胞MKN45增殖抑制活性，其增殖抑制活性为20.56±2.91μM。进一步的作用机制研究表明在MKN45细胞中化合物48ba能靶向抑制KDM5B的活性，且呈剂量依赖性诱导H3K4me2/3的蓄积，同时对KDM4和KDM6的底物几乎没有影响。另外还通过划痕实验和Transwell实验研究发现化合物48ba能剂量依赖性的抑制胃癌细胞MKN45的迁移和转移。
三、使用KDM5B抑制活性评价方法对设计合成的72个吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物（系列Ⅱ）进行了KDM5B的活性评价，结果表明吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物中IC50优于300nM的KDM5B抑制剂有13个，其中化合物84ar表现出IC50为36.1nM的最优KDM5B抑制活性。与此同时，同源蛋白的选择性研究发现化合物84ar对KDM4A、KDM4C和KDM6A具良好的选择性，其中对KDM6A的选择性为36.5倍。通过分子对接和构效关系分析发现引入氮原子将喹啉环改造成吡唑[3,4-b]并吡啶环有利于KDM5B抑制活性的提高，同时吡唑[3,4-b]并吡啶骨架上的R1和R2引入芳香性疏水基团有利于活性的增加，同吡唑类化合物类似其R3以亲水基团为宜，当含有相距三个单键的双N原子的链最佳。此外，针对部分吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物的MKN45细胞活性评价，发现化合物84ar具有6.111±0.26μM的胃癌细胞增殖抑制活性且优于阳性对照物CPI-455（IC50=23.79±1.09μM）。进一步的作用机制研究表明在MKN45胃癌细胞中化合物84ar能靶向抑制KDM5B的活性，且呈剂量依赖性诱导H3K4me2/3的蓄积，划痕实验和细胞集落形成实验也表明化合物84ar能剂量依赖性的抑制胃癌细胞的迁移。此外通过移植瘤动物模型试验证实了化合物84ar在胃癌细胞MKN45移植瘤重症联合免疫缺陷（Severe Combined Immune Deficency，简称SCID）小鼠体内能够显著抑制肿瘤增殖，且毒副作用小，为开发新型高效低毒的抗胃癌增殖药物提供了潜在先导化合物。
四、基于KDM5B与耐药之间存在紧密的关联性，本文从设计合成的两个系列化合物中挑选出了29个IC50优于300nM的KDM5B抑制剂，并利用MTT法针对结肠癌耐药细胞株SW620/AD300进行了逆转耐药活性评价，发现了5个具有良好逆转耐药活性的化合物（逆转耐药指数大于5），且细胞毒性较低。其中吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物84av能够完全逆转结肠癌耐药细胞株SW620/AD300对紫杉醇的耐药性，在8μM浓度下逆转耐药指数为371.818。随后构建了结肠癌耐药细胞株SW620/AD300移植瘤SCID小鼠模型，并通过19天的体内实验确证了化合物84av在结肠癌耐药细胞株SW620/AD300移植瘤SCID小鼠体内能够逆转细胞对紫杉醇的耐药性。化合物84av具有良好的逆转耐药活性，且毒副作用小，具有较好的应用前景，并为后期开发新型高效低毒的靶向KDM5B的逆转耐药剂提供了先导化合物。
本论文靶向KDM5B以高通量虚拟筛选出的苗头化合物为先导，运用多种药物设计策略设计合成了含吡唑结构单元的两个系列共计151个结构新颖的化合物，通过蛋白水平和细胞水平的活性筛选发现了KDM5B抑制活性IC50小于300nM的化合物29个，其中吡唑类化合物48ba和吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物84ar的活性IC50分别达到了24.4nM和36.1nM；还发现这两个化合物可特异性的靶向抑制KDM5B的活性，显著抑制MKN45细胞的增殖、侵袭和转移。进一步的动物试验证实了化合物84ar在SCID小鼠体内可显著抑制胃癌细胞移植瘤的生长，为KDM5B抑制剂治疗胃癌提供了理论和实验依据。与此同时，通过体内外逆转耐药活性评价发现吡唑[3,4-b]并吡啶类KDM5B抑制剂84av具有良好的逆转结肠癌细胞对紫杉醇的耐药活性，并为进一步开发新型高效低毒的逆转耐药剂提供了先导化合物。
本文以高通量虚拟筛选出来的苗头化合物为先导，综合运用多种药物设计策略设计合成了吡唑类和吡唑[3,4-b]并吡啶类两个系列衍生物，并从蛋白水平、细胞水平和动物水平评价了其KDM5B抑制活性和抗肿瘤活性。具体研究工作如下：
一、通过计算机辅助药物设计技术分析研究已报道的KDM5B共晶复合物的结构并创建了药效团，以KDM5B蛋白结构为受体对200万个小分子化合物进行多轮的筛选，并从中挑选出了20个打分较高且与KDM5B活性口袋结合良好的苗头化合物。随后通过课题组自建的KDM5B抑制活性评价方法的检测发现了多个具有KDM5B抑制活性的化合物，其中化合物A8和A13抑制活性IC50分别为9.3201μM和4.5572μM。分别以A8和A13为先导化合物，综合运用基于蛋白结构药物设计方法、骨架迁移、生物电子等排等多种药物设计策略设计合成了吡唑类和吡唑[3,4-b]并吡啶类两个系列共计151个结构新颖的化合物，所有合成的化合物均通过NMR和MS等波谱学方法进行了表征确证。
二、使用课题组建立的KDM5B抑制活性评价方法对79个吡唑类衍生物（系列Ⅰ）进行了蛋白水平的活性评价，结果表明吡唑类衍生物是一类高效的KDM5B抑制剂，其中有16个化合物的IC50优于300nM，以化合物48ba的IC50（24.4nM）为最佳。并且通过同源蛋白的选择性研究发现化合物48ba具有良好酶水平选择性，化合物48ba对KDM4A、KDM4C和KDM6A的IC50仅有1μM左右。通过分子对接和构效关系研究发现吡唑环骨架是该系列化合物具有KDM5B抑制活性的必须基团，且吡唑环的1位（R2）和3位（R1）引入疏水基团有利于活性的增加，化合物分子中的胺基片段（R3）以亲水基团为宜，尤其以含有相距三个单键的双N原子的链为最佳。此外，以KDM5B高表达的胃癌细胞MKN45做为受试细胞并对部分IC50优于200nM的吡唑类KDM5B抑制剂进行了细胞水平的活性评价，结果表明化合物48ba与阳性对照物CPI-455具有类似的胃癌细胞MKN45增殖抑制活性，其增殖抑制活性为20.56±2.91μM。进一步的作用机制研究表明在MKN45细胞中化合物48ba能靶向抑制KDM5B的活性，且呈剂量依赖性诱导H3K4me2/3的蓄积，同时对KDM4和KDM6的底物几乎没有影响。另外还通过划痕实验和Transwell实验研究发现化合物48ba能剂量依赖性的抑制胃癌细胞MKN45的迁移和转移。
三、使用KDM5B抑制活性评价方法对设计合成的72个吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物（系列Ⅱ）进行了KDM5B的活性评价，结果表明吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物中IC50优于300nM的KDM5B抑制剂有13个，其中化合物84ar表现出IC50为36.1nM的最优KDM5B抑制活性。与此同时，同源蛋白的选择性研究发现化合物84ar对KDM4A、KDM4C和KDM6A具良好的选择性，其中对KDM6A的选择性为36.5倍。通过分子对接和构效关系分析发现引入氮原子将喹啉环改造成吡唑[3,4-b]并吡啶环有利于KDM5B抑制活性的提高，同时吡唑[3,4-b]并吡啶骨架上的R1和R2引入芳香性疏水基团有利于活性的增加，同吡唑类化合物类似其R3以亲水基团为宜，当含有相距三个单键的双N原子的链最佳。此外，针对部分吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物的MKN45细胞活性评价，发现化合物84ar具有6.111±0.26μM的胃癌细胞增殖抑制活性且优于阳性对照物CPI-455（IC50=23.79±1.09μM）。进一步的作用机制研究表明在MKN45胃癌细胞中化合物84ar能靶向抑制KDM5B的活性，且呈剂量依赖性诱导H3K4me2/3的蓄积，划痕实验和细胞集落形成实验也表明化合物84ar能剂量依赖性的抑制胃癌细胞的迁移。此外通过移植瘤动物模型试验证实了化合物84ar在胃癌细胞MKN45移植瘤重症联合免疫缺陷（Severe Combined Immune Deficency，简称SCID）小鼠体内能够显著抑制肿瘤增殖，且毒副作用小，为开发新型高效低毒的抗胃癌增殖药物提供了潜在先导化合物。
四、基于KDM5B与耐药之间存在紧密的关联性，本文从设计合成的两个系列化合物中挑选出了29个IC50优于300nM的KDM5B抑制剂，并利用MTT法针对结肠癌耐药细胞株SW620/AD300进行了逆转耐药活性评价，发现了5个具有良好逆转耐药活性的化合物（逆转耐药指数大于5），且细胞毒性较低。其中吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物84av能够完全逆转结肠癌耐药细胞株SW620/AD300对紫杉醇的耐药性，在8μM浓度下逆转耐药指数为371.818。随后构建了结肠癌耐药细胞株SW620/AD300移植瘤SCID小鼠模型，并通过19天的体内实验确证了化合物84av在结肠癌耐药细胞株SW620/AD300移植瘤SCID小鼠体内能够逆转细胞对紫杉醇的耐药性。化合物84av具有良好的逆转耐药活性，且毒副作用小，具有较好的应用前景，并为后期开发新型高效低毒的靶向KDM5B的逆转耐药剂提供了先导化合物。
本论文靶向KDM5B以高通量虚拟筛选出的苗头化合物为先导，运用多种药物设计策略设计合成了含吡唑结构单元的两个系列共计151个结构新颖的化合物，通过蛋白水平和细胞水平的活性筛选发现了KDM5B抑制活性IC50小于300nM的化合物29个，其中吡唑类化合物48ba和吡唑[3,4-b]并吡啶类化合物84ar的活性IC50分别达到了24.4nM和36.1nM；还发现这两个化合物可特异性的靶向抑制KDM5B的活性，显著抑制MKN45细胞的增殖、侵袭和转移。进一步的动物试验证实了化合物84ar在SCID小鼠体内可显著抑制胃癌细胞移植瘤的生长，为KDM5B抑制剂治疗胃癌提供了理论和实验依据。与此同时，通过体内外逆转耐药活性评价发现吡唑[3,4-b]并吡啶类KDM5B抑制剂84av具有良好的逆转结肠癌细胞对紫杉醇的耐药活性，并为进一步开发新型高效低毒的逆转耐药剂提供了先导化合物。