第一部分 RP-HPLC测定腰痛宁胶囊中士的宁含量 腰痛宁胶囊是一种纯中药制剂，由制马钱子粉、土鳖虫等十味药组成。临床常用于腰椎间盘突出、腰椎增生等症。其组方中君药马钱子的有效成分之一为士的宁，是一种具有较强生理活性的毒性生物碱，控制制剂中士的宁含量，对控制腰痛宁胶囊质量，保证用药安全具有重要临床意义。 目的：建立腰痛宁胶囊中士的宁的含量测定方法；同时也为腰痛宁胶囊中士的宁在大鼠体内的药代动力学研究奠定基础。 方法：(1)提取方法：以溶剂种类、溶剂的碱度、超声时间作为三个因素，每个因素有三个水平，按L9(34)正交表安排实验，以士的宁的得率为指标进行优选，采用反相高效液相色谱法测定含量，通过极差与方差分析，确定最佳提取方法。(2)色谱条件的选择：选择色谱柱、检测波长、调整流动相的组成、比例、流速，使士的宁色谱峰符合检测要求。(3)系统适用性试验：在确定的色谱条件下，考察士的宁色谱峰的分离度、理论塔板数、对称因子使之符合要求。(4)标准曲线制备：配制系列浓度的士的宁标准溶液，分别进样测定峰面积，以士的宁标准溶液的浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。(5)最低检测限试验：逐步稀释士的宁的对照品溶液，进样测定，直至士的宁色谱峰的峰高为噪音的三倍。(6)精密度试验：精密吸取士的宁标准品溶液适量，在选定色谱条件下重复进样5次，记录峰面积。(7)稳定性试验：取供试品溶液分别放置0、1、2、4、6、8小时后，按已确定色谱条件测定峰面积。(8)重现性试验：取同一批号供试品6份，制备供试品溶液，分别进样测定峰面积。(9)回收率试验：取已知士的宁含量的腰痛宁胶囊6份，精密加入对照品适量，依法测定士的宁含量。(10)样品的含量测定：取腰痛宁胶囊6批，依法制备供试品溶液，分别进样测定峰面积，计算士的宁含量。 结果：(1)提取方法：最佳提取方法为甲醇氨性(20：3)溶液作溶剂超声40分钟提取。(2)最佳色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱；流动相：乙腈-10mmol·1-1碳酸氢铵(体积比28：72)，流速1.0ml·min-1；检测波长254nm；柱温25℃；进样量为20μl。(3)系统适用性试验：在上述色谱条件下士的宁峰形良好，无杂质峰干扰，保留时间8分钟左右，其理论塔板数大于4000，与相临色谱峰的分离度均大于3，不对称因子为0.97～1.14。(4)标准曲线制备：士的宁在2.00μg·ml-1～164μg·ml-1浓度范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为Y=44.46X-8.5486，相关系数r=0.9972(n=8)；(5)检测限：最低检测浓度为0.250μg·ml-1；(6)精密度试验：在两种浓度条件下试验的RSD分别为2.86％和1.72％；(7)稳定性试验：样品的峰面积的相对标准偏差RSD为1.34％，表明样品溶液在常温下8小时内稳定性良好；(8)重现性试验：样品含量的相对标准偏差RSD为2.19％，重现性良好；(9)加样回收率试验：高、中、低三种浓度的平均加样回收率分别为100.7％、99.56％、99.45％；(10)样品含量测定：腰痛宁胶囊中士的宁的含量在1.20～1.28mg·粒-1范围内。 结论：本研究所建立的对腰痛宁胶囊中士的宁提取方法和反相高效液相色谱法测定士的宁的含量，方法快速简便，精密度和准确度都符合定量分析的要求，适合腰痛宁胶囊中士的宁含量测定。 第二部分 腰痛宁胶囊中士的宁在大鼠体内的药代动力学研究 腰痛宁胶囊为常用中成药，处方中含有马钱子等毒性中药，组方中的君药马钱子的有效成分之一为士的宁，是一种具有较强生理活性的毒性生物碱，研究腰痛宁胶囊中士的宁在大鼠体内的动力学特点，具有重要意义。 目的：研究腰痛宁胶囊中士的宁在大鼠体内的动力学特点，测定观察此复方制剂中士的宁的吸收、分布、消除规律，为临床合理用药提供实验依据。 方法：(1)试验动物：SD大鼠体重190～210g，雌雄兼用。(2)血药浓度测定方法：采用RP-HPLC测定血浆样品中士的宁的浓度。(3)色谱条件的确定：选择固定相，对流动相的组成、配比、流速等因素进行分析，进行系统适用性试验，确定最佳色谱条件。(4)血液样品的预处理：取大鼠全血，加磷酸酸化并用蒸馏水稀释，涡旋混合，吸取上清液过0asisRMCX固相萃取小柱，取滤液20μl注入色谱仪，以峰面积外标法进行定量。(5)标准曲线制备：精密吸取士的宁对照品溶液适量，加至空白全血(1ml)中配制成含士的宁分别为1.00，2.00，4.00，8.00，12.0，20.0，40.0mg·l-1的对照样品溶液，按照血液样品的预处理项下同法操作，记录士的宁的峰面积.(6)最低检测限试验：以信噪比S/N≥2时，相应的士的宁的浓度为最低检测浓度。(7)回收率试验：在1ml空白全血中分别添加士的宁对照品溶液适量，照血液样品预处理项下同法操作，每个浓度5份，记录士的宁的峰面积，计算回收率。(8)精密度试验：取大鼠空白血浆加入不同浓度士的宁对照品溶液，制备1.00，2.00，5.00mg·1-1对照品全血样品，在同一天内重复测定含量5次，在不同日期分别测定5次，计算样品的日内精密度和日间精密度。(9)稳定性试验：照血液样品的预处理项下的方法处理好的样品，分别放置0、2、4、6、8、10、12小时，进样测定峰面积。(10)药动学试验设计：取禁食12小时自由饮水的SD大鼠18只，随机分为3组，分别以腰痛宁胶囊内容物的蒸馏水混悬液灌胃后，分别于0、5、10、20、30、45、60、90、120、150、180、240分钟经眼眶后静脉丛取血1ml，照血液样品预处理项下的方法处理后，进行测定，记录各样品的峰面积，计算血药浓度。(11)药动学参数的获得：取每个时间点的血药浓度均值(n=6)，采用3P97药动学软件进行自动拟合处理，以理论血药浓度值与实测血药浓度值的相关系数最大和AIC最小作为判断标准，选择最佳房室模型，计算药动学参数。 结果：(1)最佳色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)；流动相：乙腈-10mmol·l-1碳酸氢铵(氨水调PH10.5)(体积比28：72)，等度洗脱；流速1.0ml·min-1；检测波长254nm。柱温：25℃；进样量为20μl。(2)系统适用性试验：在上述色谱条件下，士的宁峰分离良好，血浆中杂质及内源性物质无干扰，样品中士的宁峰的理论塔板数均大于3000，保留时间7min左右；与相邻色谱峰的分离度均大于3。(3)标准曲线绘制：实验数据经线性回归得回归方程为：Y=45.881X+2.1752，相关系数r=0.9998，士的宁全血浓度在1.00-40.0mg·l-1时线性关系良好。(4)士的宁的最小检出限为0.250μg·ml-1。(5)回收率：四种浓度样品的回收率分别为82.67％、83.92％、87.26％、83.75％。(6)精密度：高、中、低三种浓度的样品的日内精密度分别为2.41％、1.75％、2.12％，日间精密度分别为3.48％、3.23％、4.16％。(7)稳定性：样品放置不同时间后测定，样品的峰面积的相对标准偏差RSD为3.34％，表明样品溶液在常温下12小时内稳定性良好。(8)药动学参数：大鼠灌胃后，对不同时间测得的血药浓度值进行拟合处理，腰痛宁胶囊中士的宁的药动学行为符合开放性二室模型，主要药动学参数α、β、k21、K10、k12、t1/2(a)、t1/2(α)、t1/2(β)、AUC、C1分别为0.1298min-1、0.0041min-1、0.1269min-1、0.0042min-1、0.0029min-1、2.3831min、5.3389min、169.02min、655.86μg·min·ml-1、2.804ml·min-1。 结论：本方法准确、简便，能较好地满足腰痛宁胶囊中士的宁在大鼠体内的药动学研究；研究表明：腰痛宁胶囊中士的宁在大鼠体内吸收迅速，分布范围广，消除较慢，药动学参数为临床用药提供了实验依据。