大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,是引起癌症相关死亡的第五位主要因素。虽然手术切除并辅以化学治疗和放射治疗的多模式组合治疗方法已经应用于不同阶段大肠癌的治疗,但目前大肠癌患者的死亡率仍然较高。尽管目前很多研究致力于大肠癌的早期诊断和靶向治疗,但仍缺少较为有效的生物标志物及预测指标。因此,进一步研究并明确有效的肿瘤标志物及治疗靶标对于提高大肠癌患者的生存率至关重要。表皮生长因子受体 ErbB3 结合蛋白(ErbB3 receptor binding protein 1,EBP1)是PA2G4蛋白家族成员,广泛表达于人类组织并参与调控细胞生长、细胞分化和细胞凋亡。研究表明EBP1有两个亚型,分别为P48和P42。由于EBP1基因的选择性剪切,P48亚型比P42亚型在N-端多54个氨基酸,这导致EBP1 P48和EBP1 P42有不同的生物学功能。EBP1 P48在细胞质和细胞核中均有表达,能促进细胞增殖并抑制细胞分化。研究报道在胰腺癌、宫颈癌和前列腺癌中EBP1 P48均表达增高,且高表达的EBP1 P48与肿瘤不良预后相关,提示EBP1 P48能促进肿瘤发生发展。与EBP1 P48的原癌基因作用相反,EBP1 P42通过抑制细胞增殖和促进细胞分化而发挥抑癌基因作用。虽然目前已经明确EBP1 P48有癌基因活性而EBP1 P42主要发挥抑癌基因功能,但EBP1不同亚型在肿瘤中发挥不同生物学功能的调控机制尚不明确。FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing7)属于 F-box 蛋白家族,是 SCF(Skp1/Cul1/F-box)E3泛素连接酶复合体的靶蛋白识别组分。FBXW7包含两个重要的功能结构域:F-box结构域和WD40结构域;F-box结构域可与Skp1结合形成SCFFBXW7复合体,WD40结构域识别并结合特异性磷酸化底物(CPD),介导靶蛋白的泛素化降解。FBXW7在多种肿瘤中存在表达缺失或突变,其表达减低或功能缺失诱导肿瘤的发生发展。研究报道FBXW7主要通过靶向泛素化降解癌蛋白发挥其抑癌作用,包括cyclin E,Notch,mTOR,Aurora-A和c-Myc等,从而参与调控细胞周期进程、细胞增殖、细胞分化、DNA损伤应答和基因组稳定性维持。作为肿瘤抑制基因,FBXW7的抑癌作用已被广泛研究,然而目前对于FBXW7靶底物的鉴定及FBXW7表达缺失诱导肿瘤发生发展的机制研究并不充分。理解并研究FBXW7的生物学功能和新的作用网络对于研究其抑癌作用和进一步研发靶向药物具有重要意义。本研究主要探讨FBXW7与EBP1亚型的差异性相互作用及作用机制,明确FBXW7差异性调控EBP1亚型在肿瘤发生发展中的作用及意义。本研究的完成不仅进一步明确了 FBXW7的肿瘤生物学功能,也为探索以FBXW7为靶标的早期诊断指标及治疗靶点提供了理论依据。第一部分FBXW7差异性调控EBP1亚型表达及机制研究[目的]应用双向凝胶电泳(2-DE)和质谱分析技术(MS)鉴定FBXW7新的靶底物,分析FBXW7对新鉴定靶底物的表达调控并明确调控机制,为进一步研究FBXW7的生物学功能和新的调控通路奠定基础。[方法]1.FBXW7新靶底物鉴定1.1应用HCT116 FBW7+和FBBW7-/-细胞系,采用2-DE和MS分析FBXW7的新靶蛋白。1.2在人乳腺癌细胞MDA-MB-468、人前列腺癌细胞DU145和PC3中,通过逆转录病毒转染 pSuper-puro-shFBXW7 A、pSuper-puro-shFBXW7 B 及其空 白 对照质粒,构建FBXW7稳定低表达的细胞株及其对照组细胞。应用qRT-PCR和Western blot分别检测所构建细胞系中FBXW7 mRNA及蛋白的表达,同时检测FBXW7新鉴定靶蛋白EBP1的表达。1.3 构建 Myc-EBPl P48 和 Myc-EBP1 P42 表达质粒,分别与 HA-FBXW7α 或HA-FBXW7α△F(F-box 缺失)质粒共同转染 HEK293T 细胞,Western blot 检测FBXW7对EBP1不同亚型的表达调控。2.FBXW7对EBP1 P48的降解及机制研究2.1 Myc-EBP1 P48 分别与 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 共同转染 HEK293T 细胞,应用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX,50μg/ml)分别处理细胞Oh,1.5h,4h,6h,8h,Western blot 检测 FBXW7 对外源 EBP1P48 半衰期的影响。同样方法处理HCT116F FBXW7+/+、HCT116FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7+/+、DLD-1 FBXW7-/-细胞,Western blot进一步检测FBXW7对内源EBP1 P48半衰期的影响。2.2 Myc-EBP1 P48 分别与 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 共同转染 HEK293T 细胞,分别应用CHX或CHX与蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)共同处理细胞6h,Western blot检测MG132是否抑制FBXW7对EBP1 P48的降解。同样方法处理HCT116FBXW7+/+、HCT116FBXW7-/-和DLD-1FBXW7++、DLD-11FBXW7-/-细胞,Western blot进一步验证MG132对FBXW7降解EBP1 P48的影响。2.3 Flag-EBP1 P48、HA-Ubiquitin 和 Myc-FBXW7α 共同转染 HEK293T 细胞,免疫沉淀实验检测FBXW7对EBP1 P48泛素化的影响。同时在HCT116 FBXW7+/+、HCT116 FBXW7-/-细胞中分别转染HA-Ubiquitin,免疫沉淀实验检测不伺FBXW7表达量对EBP1 P48泛素化水平的影响。2.4 Flag-EBP1 P48转染HEK293T细胞,免疫共沉淀实验检测EBP1 P48与GSK3β是否结合。2.5 Myc-EBP1 P48与HA-FBXW7α共同转染HEK293T细胞,其中一组细胞应用GSK3β抑制剂Ⅶ进行处理,Western blot检测GSK3β抑制剂VⅦ对FBXW7降解EBP1 P48的影响。同样方法处理HCT116 FBXW7+/+和HCT116 FBXW7-/-细胞,Western blot进一步验证FBXW7对EBP1 P48的降解是否依赖于GSK3β对EBP1 P48的磷酸化。2.6 HA-Ubiquitin转染HEK293T细胞,同时应用GSK3β抑制剂Ⅷ处理细胞,免疫沉淀实验检测GSK3β抑制剂Ⅷ是否影响EBP1 P48的泛素化水平。3.检测FBXW7是否与EBP1 P48相互结合并确定结合位点3.1检测FBXW7与EBP1 P48的相互结合HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分别与 Flag-EBPl P48 共同转染 HEK293T 细胞,免疫共沉淀检测FBXW7与EBP1 P48的结合。同时应用免疫共沉淀实验检测HCT116细胞中内源FBXW7与内源EBP1 P48的结合。3.2检测FBXW7与EBP1 P48结合的功能位点3.2.1 HA-FBXW7α,HA-FBXW7α△F、HA-FBXW7α△WD(WD40 结构域表达缺失)和 HA-FBXW7αWD 结构域点突变质粒(R465C、R465H、R479H、R505C)分别与F1ag-EBPl P48共同转染HEK293T细胞,免疫共沉淀实验检测FBXW7表达缺失或突变质粒与EBP1 P48的结合,确定FBXW7与EBP1 P48结合的功能片段。3.2.2根据3.2.1中确定的FBXW7功能片段,将缺失该片段的FBXW7与Flag-EBPl P48和Myc-Ubiquitin共同转染HEK293T细胞,免疫沉淀实验检测其对EBP1 P48泛素化的影响,同时应用Western blot检测FBXW7缺失该片段后对EBP1 P48蛋白表达的影响。3.3分析EBP1 P48与FBXW7相互作用的功能位点3.3.1应用磷酸位点分析软件分析EBP1 P48蛋白序列中可能的GSK3β磷酸化位点,根据预测结果构建EBP1 P48表达缺失质粒Myc-EBPl P48△40-44和Myc-EBPl P48△88-94。3.3.2 HA-FBXW7α 分别与 Myc-EBPl P48A40-44 或 Myc-EBPl P48A88-94 共同转染HEK293T细胞,免疫共沉淀检测EBP1 P48△40-44或EBP1 P48A88-94与FBXW7的结合。3.3.3 HA-FBXW7α 分别与 Myc-EBPl P48△40-44 或 Myc-EBPl P48A88-94 共同转染 HEK293T 细胞,Western blot 检测 FBXW7 对 Myc-EBPl P48A40-44 或Myc-EBP1 P48A88-94蛋白表达的影响。同时应用CHX处理细胞,Western blot进一步检测 FBXW7 对 Myc-EBP1 P48A40-44 或 Myc-EBP1 P48△88-94 半衰期的影响。3.3.4 Myc-EBP1P48△40-或 Myc-EBP1 P48A88-94 分别与HA-FBXW7 共同转染HEK293T细胞,应用CHX或CHX与MG132共同处理细胞6h,Western blot检测在 MG132 作用下 FBXW7α 对 Myc-EBP1 P48△40-44 或 Myc-EBP1 P48A88-94蛋白表达的影响。3.3.5根据上述结果明确EBP1 P48功能片段,构建针对该片段的EBP1 P48点突变质粒Flag-EBP1 P48S40A,将该质粒与FBXW7共同转染HEK293T细胞,Western blot检测FBXW7对EBP1 P48S40A蛋白表达的影响。3.3.6 Flag-EBP1 P48S40A 与 HA-FBXW7α 共同转染 HEK293T 细胞,免疫共沉淀检测FBXW7与EBP1 P48S40A是否结合。3.3.7 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分别与 Flag-EBP1 P48S40A 和 Myc-Ubiquitin 共同转染HEK293T细胞,免疫沉淀实验检测FBXW7是否影响EBP1 P48S40A的泛素化水平。[结果]1.FBXW7差异性调控EBP1亚型的表达。1.1 2-DE和MS实验提示EBP1为FBXW7新的靶蛋白。1.2成功构建MDA-MB-468、DU145和PC3稳定低表达FBXW7细胞系,qRT-PCR和Western blot验证细胞系构建成功;FBXW7低表达能明显上调EBP1 P48的表达量,而对EBP1 P42的表达量无影响。1.3高表达FBXW7能显著降低EBP1 P48的蛋白表达,而对EBP1 P42的蛋白表达无影响。2.FBXW7以GSK3β依赖方式泛素化降解EBP1 P48。2.1在CHX作用下,高表达FBXW7能显著缩短EBP1 P48半衰期,而HCT116细胞中FBXW7表达缺失显著延长EBP1 P48半衰期。2.2应用蛋白酶体抑制剂MG132能阻断FBXW7对EBP1 P48的降解。2.3 FBXW7能促进EBP1 P48的泛素化水平。2.4 EBP1 P48 与 GSK3β 相互结合。2.5 FBXW7对EBP1 P48的降解依赖于GSK3β对EBP1 P48的磷酸化。2.6GSK3β抑制剂Ⅷ能抑制EBP1 P48的泛素化水平。3.FBXW7通过其WD40结构域与EBP1 P48 S40相互结合。3.1 FBXW7 与 EBP1 P48 相互结合。3.2 FBXW7通过其WD40结构域与EBP1 P48结合,缺失WD40结构域影响FBXW7对EBP1 P48的泛素化降解。3.3 EBP1 P48通过其第40位丝氨酸位点与FBXW7相结合3.3.1 成功构建 EBP1 P48 表达缺失质粒 Myc-EBP1 P48△40-44 和 Myc-EBP1 P48△88-94。3.3.2 EBP1 P48缺失第40-44位氨基酸后不能与FBXW7结合,而缺失第88-94位氨基酸仍然可以与FBXW7结合。3.3.3 FBXW7能降低EBP1 P48A88-94的蛋白表达且明显缩短其半衰期,而对EBP1 P48A40-44的蛋白表达和半衰期无影响。3.3.4 MG132 能阻断 FBXW7 对 EBP1 P48A88-94 的降解,而对 EBP1 P48A40-44的表达无影响。3.3.5成功构建Flag-EBP1 P48S40A(丝氨酸突变为丙氨酸)质粒。Western blot结果表明FBXW7对EBP1 P48S40A的蛋白表达无影响。3.3.6 FBXW7 与 EBP1 P48S40A 不结合。3.3.7 FBXW7不能影响EBP1 P48S40A的泛素化水平。[结论]1.FBXW7差异性调控EBP1亚型的表达2.EBP1 P48是FBXW7的靶底物:FBXW7通过泛素-蛋白酶体途径降解EBP1 P48,且这一降解作用依赖于GSK3β对EBP1 P48的磷酸化作用。3.FBXW7与EBP1 P48相互结合:FBXW7通过WD40结构域与EBP1 P48结合,而EBP1 P48通过第40位丝氨酸位点与FBXW7结合。第二部分EBP1 P48介导FBXW7对大肠癌细胞的作用及机制研究[目的]第一部分研究结果表明FBXW7靶向调控EBP1 P48蛋白表达,本部分通过体外细胞实验和裸鼠体内转移瘤模型检测FBXW7对大肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及转移的抑制作用是否通过EBP1 P48介导,并探讨EBP1 P48介导FBXW7功能的分子机制。[方法]1.在HCT116FBXW7-/-细胞中特异性干扰EBP1 P48的表达,通过MTT实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力的改变;通过细胞划痕实验、Transwell实验检测干扰EBP1 P48的表达对细胞迁移能力的影响;通过Matrigel实验检测干扰EBP1 P48的表达对细胞侵袭能力的影响。2.应用HCT116FBBW7+/+、FBXXW7-/-和FBXW7-/-shEBP1 P48细胞系建立裸鼠体内转移瘤模型,通过HE染色检测肿瘤转移情况,研究FBXW7表达缺失引起的肿瘤转移是否通过EBP1 P48介导。3.应用免疫组织化学染色检测大肠癌肿瘤组织和癌旁正常组织中FBXW7和EBP1P48的表达,并分析其表达相关性。4.HA-FBXW7α和F1ag-EBP1 P48共同转染HEK293T细胞,分别提取细胞质蛋白和细胞核蛋白,Western blot检测EBP1 P48是否影响FBXW7的细胞内定位;同时应用免疫荧光实验进行进一步验证。5.HCT116FBXW7+/+、FBXW7-/-细胞中分别转染EBP1 P48,应用qRT-PCR和Western blot分别检测EBP1 P48对FBXW7靶底物mRNA和蛋白表达的影响。6.HA-FBXW7α和Flag-EBP1 P48共同转染HEK293T细胞,免疫共沉淀检测EBP1 P48是否抑制FBXW7与已知靶底物的结合。[结果]1.HCT116FBXW7-/-细胞中干扰EBP1 P48的表达能逆转因FBXW7表达缺失引起的大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变。2.裸鼠体内转移瘤实验表明干扰EBP1 P48表达能抑制FBXW7表达缺失引起的大肠癌细胞体内转移能力的改变。3.与正常组织相比,大肠癌组织中FBXW7表达明显减低,而EBP1P48表达明显增高,统计学分析提示两者表达量呈负相关。4.EBP1 P48促进FBXW7由细胞核向细胞质移位。5.EBP1 P48抑制FBXW7对靶底物的降解。6.EBP1 P48抑制FBXW7与靶底物的结合。[结论]1.EBP1 P48介导FBXW7表达缺失引起的大肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及体内转移能力的改变。2.EBP1 P48能促进FBXW7由细胞核向细胞质移位,从而抑制FBXW7与靶底物的结合,进而抑制FBXW7对靶底物的降解。第三部分EBP1 P42促进FBXW7对大肠癌细胞的抑癌作用及机制研究[目的]第一部分结果表明FBXW7对EBP1 P42蛋白表达没有影响,但EBP1 P42作为EBP1的一个亚型是否与EBP1 P48 一样参与FBXW7功能调控还未知。该部分拟通过一系列实验研究EBP1 P42与FBXW7是否有相互作用,明确EBP1 P42与FBXW7的相互作用对大肠癌细胞生物学功能的影响。[方法]1.HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分别与 Flag-EBP1 P42 共同转染 HEK293T 细胞,免疫共沉淀检测FBXW7与EBP1 P42是否结合。2.HA-FBXW7α,HA-FBXW7α△F、HA-FBXW7α△WD、HA-FBXW7αN△F(F-box和WD40结构域均缺失)和HA-FBXW7αWD结构域点突变质粒(R465C、R465H、R479H、R505C)分别与Flag-EBP1 P42共同转染HEK293T细胞,免疫共沉淀实验检测FBXW7表达缺失或突变质粒与EBP1 P42的结合,确定FBXW7与EBP1 P42结合的功能片段。3.根据上述结果构建HA-FBXW7α△FR465C(F-box结构缺失且WD40结构域第465位氨基酸突变)质粒,将该质粒与Flag-EBP1 P42共同转染HEK293T细胞,免疫共沉淀检测两者是否相互结合。4.HA-FBXW7α、Myc-FBXW7α 和 Flag-EBP1 P42 共同转染 HEK293T 细胞,免疫共沉淀检测EBP1 P42是否影响FBXW7的二聚化,同时检测EBP1 P42是否影响FBXW7与已知靶底物的结合。5.HCT116 FBXW7+/+、FBXW7-/-细胞中分别转染EBP1 P42,应用qRT-PCR和Western blot分别检测EBP1 P42对FBXW7靶底物mRNA和蛋白表达的影响。6.HA-FBXW7α 分别与 Flag-Vector 或 Flag-EBP1 P42 共同转染 HCT116FBXW7-/-细胞,通过MTT实验、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验检测EBP1 P42是否能增强FBXW7的肿瘤抑制作用。[结果]1.FBXW7与EBP1 P42相互结合。2.FBXW7可通过F-box结构域直接与EBP1 P42结合。3.FBXW7靶底物介导EBP1 P42与FBXW7 WD40结构域的结合。4.EBP1 P42促进FBXW7二聚化并增强FBXW7与靶底物的结合。5.EBP1 P42促进FBXW7对靶底物的降解。6.EBP1 P42能增强FBXW7的肿瘤抑制作用。[结论]1.FBXW7可通过F-box结构域直接与EBP1 P42结合,此外FBXW7靶底物可介导EBP1 P42与FBXW7 WD40结构域的结合。2.EBP1 P42能促进FBXW7二聚化,并促进FBXW7对靶底物的降解。3.EBP1 P42能增强FBXW7的抑癌作用。