烟草中褪黑素合成酶基因SNAT的克隆与功能探究

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烟草(Nicotiana tabacum)是一种重要的经济作物,其生长发育和产量常常受到多种病虫害以及各种环境胁迫的影响,造成巨大的经济损失。褪黑素在植物生长发育过程以及植物抗逆性方面发挥重要的作用。5-羟色胺N-乙酰转移酶(Serotonin N-acetyltransferase,SNAT)是参与植物褪黑素生物合成的最后一步或倒数第二步酶,目前为止,烟草中的SNAT基因尚未被鉴定。因此,本研究检索并鉴定烟草中的SNAT基因家族成员,并对其理化性质、基因结构、系统发育关系和表达模式进行分析,并构建NtSNAT1和NtSNAT2基因的原核表达载体和过表达载体,诱导蛋白表达,并对转基因烟草进行相关生理指标检测。为阐明烟草SNAT基因的进化关系、功能研究以及未来提高烟草抗逆性及产量的遗传资源提供了参考。主要研究结果如下:(1)本研究以乙酰转移酶_7保守结构域的序列作为查询序列,在烟草基因组中鉴定出12个NtSNAT候选基因。根据系统发育树,这些NtSNAT候选基因可分为两类。NtSNAT1和NtSNAT2与其他典型SNAT聚在一支,而其他10个NtSNAT则单独聚在一支。此外,这10个NtSNAT只有motif 1,而代表性SNAT,如NtSNAT1和NtSNAT2或蓝藻SNAT有5个motif。(2)NtSNAT1和NtSNAT2分别与已鉴定的水稻Os SNAT1分别有62.95和71.36%的同源性;而其他10个NtSNAT基因与水稻Os SNAT1的同源性较低。因此,我们推测NtSNAT1和NtSNAT2是SNATs的同源基因,而其他10个候选基因可以被认为是NtSNAT-like基因。(3)普通烟草(Nicotiana tabacum)的两个二倍体祖先种林烟草(Nicotiana sylvestris)和绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)都分别有两个SNAT候选基因,而普通烟草只有两个SNAT同源基因,因此,推测普通烟草从二倍体进化到异源四倍体的过程中,基因在全基因组复制或多倍化后的基因组稳定过程中发生了基因重排或缺失,导致了NtSNAT1和NtSNAT2的保存。(4)NtSNAT和NtSNAT-like基因在不同胁迫条件下以及不同组织均有不同程度的表达,表明这些基因可能与植物的生长发育和抗逆性有关。值得注意的是,在高温和镉胁迫下NtSNAT1的表达量均显著上调,而高温和镉胁迫下NtSNAT2的表达量均未显著上调。(5)为了验证NtSNAT1和NtSNAT2的功能,构建了原核表达载体,诱导NtSNAT1和NtSNAT2蛋白表达,为验证其在离体条件下的功能做铺垫。此外,构建了NtSNAT1和NtSNAT2过表达载体并将其导入烟草中。与野生型植株相比,过表达成功的植株中NtSNAT1和NtSNAT2基因的表达量显著上调,且褪黑素含量也显著增加。
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