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背景:
钛及钛合金是临床上用于种植义齿修复最常见的材料，对种植体的表面改性及种植体骨结合相关分子机制的研究一直是该领域的热点。在种植体骨结合过程中骨免疫发挥至关重要的作用，自噬在维持骨稳态过程中亦发挥重要作用，但骨免疫是否通过影响自噬进而影响骨结合尚不清楚。近年来外泌体及其内容物被证明在免疫系统和骨骼系统的联系中发挥重要的细胞间通讯作用，同时亦有报道指出，外泌体的释放与自噬的活性是一个协调的过程，有利于维持细胞稳态;而目前对于外泌体和自噬在骨免疫微环境影响骨结合的作用及相关分子机制的研究较少。
目的:
本实验通过制备光滑、微纳复合形貌钛盘，分离被不同钛盘刺激后的巨噬细胞来源的外泌体，研究骨免疫、巨噬细胞来源外泌体、自噬三者的关系及其对骨形成的影响，深入分析微纳复合形貌钛盘形成的骨免疫微环境通过外泌体/自噬影响骨结合的机制，为种植体骨结合的机制研究提供理论参考。
方法:
1、采用抛光方法制备光滑钛盘、喷砂-酸蚀-碱热处理制备微纳复合形貌钛盘，利用扫描电子显微镜观察钛盘表面形貌，光学轮廓仪检测表面粗糙度，悬滴法测量接触角。
2、分别在光滑、微纳复合形貌钛盘表面培养小鼠源系RAW264.7细胞，采用qRT-PCR检测RAW264.7细胞炎性相关因子的表达，并提取其培养基上清，采用超速离心法分离不同钛盘刺激后的RAW264.7细胞来源的外泌体，采用透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小，采用纳米颗粒追踪技术检测外泌体的大小，采用Westernblot检测外泌体相关标记蛋白的表达。
3、首先，为研究自噬在骨免疫促进骨形成中的重要作用，在有/无自噬抑制剂的条件下，对MC3T3-E1细胞进行分组:对照组、RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组;其次，为研究外泌体在骨免疫促进骨形成中的重要作用，对MC3T3-E1细胞进行分组:对照组、RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组、RAW264.7细胞来源外泌体/MC3T3-E1细胞共培养组。采用qRT-PCR、Westernblot检测MC3T3-E1细胞自噬相关标记物、成骨相关标记物的表达，采用CCK-8法检测MC3T3-E1细胞增殖效果，采用茜素红染色及半定量分析检测MC3T3-E1细胞成骨矿化效果，采用免疫荧光染色检测MC3T3-E1细胞的自噬小体。
结果:
1、光滑钛盘表面较平整，未见明显划痕;低倍镜下微纳复合形貌钛盘表面粗糙，可见大量连续叠加凹坑，在直径10-50μm的一级凹陷表面叠加直径2-8μm的二级凹陷，高倍镜下可见纳米孔，直径50-200nm。与光滑钛盘相比，微纳复合形貌钛盘的接触角显著降低(p＜0.05)，平均粗糙度显著增加(p＜0.05)。
2、与光滑钛盘相比，微纳复合形貌钛盘可刺激RAW264.7细胞抗炎相关基因IL-10表达增加，促炎相关基因IL-1β表达降低。
3、与MC3T3-E1细胞单独培养组相比，RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组成骨细胞相关标记物表达增高，细胞增殖、矿化效果更优;抑制自噬后成骨相关标记物的表达降低，细胞增殖被抑制，矿化减少。
4、采用超速离心法分离出外泌体后对其进行表征，透射电镜下观察其呈圆形的双层膜结构，纳米颗粒追踪分析发现其基本处于30-200nm的分布范围，Westernblot检测到外泌体表面蛋白CD9、CD63、TSG101的表达。
5、使用M2型RAW264.7细胞来源的外泌体刺激MC3T3-E1细胞后，与对照组、RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组相比，RAW264.7细胞来源外泌体/MC3T3-E1细胞共培养组成骨细胞相关标记物表达显著增高，细胞增殖、矿化效果显著增强。荧光染色结果显示，RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组、RAW264.7细胞来源外泌体/MC3T3-E1细胞共培养组均可激活MC3T3-E1细胞的自噬水平。
结论:
1、微纳复合形貌可刺激RAW264.7细胞形成抗炎免疫微环境，有利于成骨分化和矿化;
2、自噬在抗炎骨免疫微环境促进成骨过程中发挥重要作用;
3、M2型巨噬细胞来源的外泌体在抗炎骨免疫微环境促进成骨过程中发挥重要作用;
4、M2型巨噬细胞来源的外泌体可能通过调节MC3T3-E1细胞的自噬水平进而影响成骨过程。
钛及钛合金是临床上用于种植义齿修复最常见的材料，对种植体的表面改性及种植体骨结合相关分子机制的研究一直是该领域的热点。在种植体骨结合过程中骨免疫发挥至关重要的作用，自噬在维持骨稳态过程中亦发挥重要作用，但骨免疫是否通过影响自噬进而影响骨结合尚不清楚。近年来外泌体及其内容物被证明在免疫系统和骨骼系统的联系中发挥重要的细胞间通讯作用，同时亦有报道指出，外泌体的释放与自噬的活性是一个协调的过程，有利于维持细胞稳态;而目前对于外泌体和自噬在骨免疫微环境影响骨结合的作用及相关分子机制的研究较少。
目的:
本实验通过制备光滑、微纳复合形貌钛盘，分离被不同钛盘刺激后的巨噬细胞来源的外泌体，研究骨免疫、巨噬细胞来源外泌体、自噬三者的关系及其对骨形成的影响，深入分析微纳复合形貌钛盘形成的骨免疫微环境通过外泌体/自噬影响骨结合的机制，为种植体骨结合的机制研究提供理论参考。
方法:
1、采用抛光方法制备光滑钛盘、喷砂-酸蚀-碱热处理制备微纳复合形貌钛盘，利用扫描电子显微镜观察钛盘表面形貌，光学轮廓仪检测表面粗糙度，悬滴法测量接触角。
2、分别在光滑、微纳复合形貌钛盘表面培养小鼠源系RAW264.7细胞，采用qRT-PCR检测RAW264.7细胞炎性相关因子的表达，并提取其培养基上清，采用超速离心法分离不同钛盘刺激后的RAW264.7细胞来源的外泌体，采用透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小，采用纳米颗粒追踪技术检测外泌体的大小，采用Westernblot检测外泌体相关标记蛋白的表达。
3、首先，为研究自噬在骨免疫促进骨形成中的重要作用，在有/无自噬抑制剂的条件下，对MC3T3-E1细胞进行分组:对照组、RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组;其次，为研究外泌体在骨免疫促进骨形成中的重要作用，对MC3T3-E1细胞进行分组:对照组、RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组、RAW264.7细胞来源外泌体/MC3T3-E1细胞共培养组。采用qRT-PCR、Westernblot检测MC3T3-E1细胞自噬相关标记物、成骨相关标记物的表达，采用CCK-8法检测MC3T3-E1细胞增殖效果，采用茜素红染色及半定量分析检测MC3T3-E1细胞成骨矿化效果，采用免疫荧光染色检测MC3T3-E1细胞的自噬小体。
结果:
1、光滑钛盘表面较平整，未见明显划痕;低倍镜下微纳复合形貌钛盘表面粗糙，可见大量连续叠加凹坑，在直径10-50μm的一级凹陷表面叠加直径2-8μm的二级凹陷，高倍镜下可见纳米孔，直径50-200nm。与光滑钛盘相比，微纳复合形貌钛盘的接触角显著降低(p＜0.05)，平均粗糙度显著增加(p＜0.05)。
2、与光滑钛盘相比，微纳复合形貌钛盘可刺激RAW264.7细胞抗炎相关基因IL-10表达增加，促炎相关基因IL-1β表达降低。
3、与MC3T3-E1细胞单独培养组相比，RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组成骨细胞相关标记物表达增高，细胞增殖、矿化效果更优;抑制自噬后成骨相关标记物的表达降低，细胞增殖被抑制，矿化减少。
4、采用超速离心法分离出外泌体后对其进行表征，透射电镜下观察其呈圆形的双层膜结构，纳米颗粒追踪分析发现其基本处于30-200nm的分布范围，Westernblot检测到外泌体表面蛋白CD9、CD63、TSG101的表达。
5、使用M2型RAW264.7细胞来源的外泌体刺激MC3T3-E1细胞后，与对照组、RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组相比，RAW264.7细胞来源外泌体/MC3T3-E1细胞共培养组成骨细胞相关标记物表达显著增高，细胞增殖、矿化效果显著增强。荧光染色结果显示，RAW264.7细胞/MC3T3-E1细胞共培养组、RAW264.7细胞来源外泌体/MC3T3-E1细胞共培养组均可激活MC3T3-E1细胞的自噬水平。
结论:
1、微纳复合形貌可刺激RAW264.7细胞形成抗炎免疫微环境，有利于成骨分化和矿化;
2、自噬在抗炎骨免疫微环境促进成骨过程中发挥重要作用;
3、M2型巨噬细胞来源的外泌体在抗炎骨免疫微环境促进成骨过程中发挥重要作用;
4、M2型巨噬细胞来源的外泌体可能通过调节MC3T3-E1细胞的自噬水平进而影响成骨过程。