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猪瘟(Classical swine fever ,CSF)是严重危害养猪业的传染性疾病,病原为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)。CSFV为单股正链RNA病毒,研究发现其3′非翻译区(3′-non-translation region,3′-NTR)在病毒的复制中有重要作用,为了研究CSFV Shimen株3′-NTR的不同位点在病毒复制中的作用,筛选3个靶位点设计了短发夹RNA(shRNA),构建了针对shimen株CSFV 3′-NTR 3个靶位点的shRNA表达质粒;将重组质粒转染PK-15细胞,获得3株稳定靶向CSFV Shimen株3′-NTR 3个靶位点的干扰细胞株,接种CSFV后,检测干扰细胞株对病毒复制的影响。目前CSF防控上采取的是以疫苗免疫接种为主的策略,弱毒疫苗的大范围使用,使病毒变异、毒力返强的风险增高,当前临床上“非典型”CSF的大量出现,被怀疑与弱毒疫苗的大量使用有关,新型CSF疫苗的研制是防控CSF的需要;在分析国内外有关猪瘟基因工程疫苗研究进展的基础上,构建了表达CSFV Shimen株E2基因的“自杀性”DNA疫苗和同时表达CSFV Shimen株E0和E2基因的重组鸡痘病毒,对构建的疫苗进行了初步评价。CSF弱毒疫苗的大量使用,使在生产中难以有效地用血清学方法区分野毒感染猪和疫苗免疫猪,对生猪及其产品的贸易造成严重影响;针对这个问题,在借鉴已有研究的基础上,建立了区分CSFV强/弱毒株的RT-PCR方法,通过对临床病料的检测表明,该方法的特异性较强,可用于临床上对CSFV野毒感染和弱毒疫苗免疫猪的鉴别检测。本研究取得以下结果:1.通过对CSFV Shimen株3′-NTR核苷酸序列的分析,分别设计了靶向CSFV Shimen株3′-NTR 115～132位、137～154位和210～228位mRNA的短发夹RNA(shRNA)的单链核苷酸,经退火后形成双链shRNA,将其分别与siRNA表达质粒载体连接,构建了编码CSFV Shimen株3′-NTR 3个位点shRNA的表达质粒载体;转染细胞后筛选获得了稳定转录靶向CSFV Shimen株3′-NTR shRNA PK-15细胞株(P-1、P-2和P-3);接毒试验表明,细胞株P-1、P-2及P-3在转录水平和蛋白表达水平上均可干扰CSFV Shimen株在感染细胞中的增殖(P<0.05)。2.建立了可鉴别CSFV强毒和弱毒的RT-PCR方法。在CSFV强毒中可扩增得到187 bp的片段,弱毒可获得492 bp的片段;在对PCV2、TGEV、PRRSV等猪源病毒的检测,均未有PCR产物出现,说明方法的特异性较高。对临床疑是CSF病料的检测证明,建立的方法可有效地区分CSFV野毒感染猪和弱毒疫苗免疫猪,本方法可用于临床上对CSFV强弱毒的鉴别检测。3.构建了CSFV E2基因“自杀性”DNA疫苗表达质粒载体PSCA1-E2。在转染细胞中可检测到E2蛋白的表达;免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)在二免后10d与对照组差异显著(p<0.05),20d和30d差异极显著(p<0.01);试验猪二免后21d能检测到抗CSFV特异性血清抗体,说明构建的表达CSFV E2基因的“自杀性”DNA疫苗能诱导试验动物的免疫反应。4.将CSFV E0和E2基因及报告基因LacZ插入到鸡痘病毒FV282的复制非必需区,经同源重组构建了一株含CSFV E0和E2基因的重组鸡痘病毒(FV282-E0-E2)。用重组鸡痘病毒免疫接种试验小鼠和试验猪,检测发现,免疫动物均能产生特异性抗体,说明E0和E2基因在机体细胞内得以有效表达,并能激发机体产生免疫反应;对免疫猪的攻毒试验表明,重组鸡痘病毒免疫猪能获得部分的免疫保护,抵抗CSFV强毒的攻击,免疫保护率为75%(6/8)。