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研究背景课题组前期研究发现,TP53(p53突变体)能通过调控p27kip1的表达和核输出来促进肺鳞癌细胞的增殖和迁移,但其机制尚不明了。p53在正常细胞蛋白质编码、分裂和分化等中起关键作用,但突变后,就会失去对细胞分化和DNA损伤修复等的调控作用,转变成癌基因。P27Kip1是一种细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制剂,可特异性地作用于细胞G1晚期而阻断G1/S期的进展,进而在真核细胞周期调控中发挥重要作用。作为一种公认的抑癌基因,P27Kip1抑制细胞增殖,促进细胞凋亡;但也可表现出致癌活性,主要是由于其在细胞内的定位改变所致。一般认为,胞质p27kip1具有抑制细胞凋亡的作用;而胞核p27kip1(作为CDKI)具有阻断细胞周期和促进凋亡的作用。因此,p27kip1的功能发挥不仅与其表达水平相关,而且还取决于其细胞定位。c-myc是一种广谱癌基因,可使细胞无限增殖,广泛参与包括肺鳞癌在内的多种肿瘤的发生发展。染色体维持蛋白1(CRM1),是一种重要的运输蛋白,参与多种肿瘤抑制因子(例如,p53和核磷蛋白等)的出核转运,在肿瘤的进程中发挥重要作用。结合前期研究基础,我们推测:1.TP53通过激活c-myc信号通路抑制p27kip1表达来促进肺鳞癌细胞增殖;2.TP53上调CRM1表达促进p27kip1出核转运并与p27kip1表达水平下调协同作用,进一步促进肺鳞癌细胞的增殖。本课题将从细胞、分子和临床水平等多角度来验证这一推测。研究目的探讨TP53调控p27Kip表达和核输出的作用机制,为阐明肺鳞癌发生发展的机制提供新的依据,同时有望为肺鳞癌治疗提供新的靶标。研究思路与方法1.选择p53突变型细胞课题组前期利用Sanger测序确认肺鳞癌细胞SK-MES-1为p53突变型细胞。2.进一步确定TP53抑制p27Kip1表达前期研究发现,si RNA下调TP53表达后,SK-MES-1细胞p27kip1 m RNA和蛋白表达均显著增加。为进一步明确TP53对p27Kip1表达的影响,本研究利用免疫组化方法检测肺鳞癌组织标本TP53和p27Kip1的表达;并构建慢病毒过表达TP53载体,利用q PCR和WB实验来观察上调TP53对p27kip1 m RNA和蛋白表达的影响,以进一步确定TP53抑制p27Kip表达。3.明确TP53通过调控p27Kip1表达来影响SK-MES-1细胞周期和增殖前期及上述研究已证实TP53促进SK-MES-1增殖、抑制p27Kip1表达,提示p27Kip1在TP53对肺鳞癌细胞增殖的影响中发挥重要作用。本研究首先利用流式细胞术Brdu摄人实验测定下调p53后细胞周期的变化;然后利用CCK-8实验分别测定下调TP53以及同时下调TP53和p27Kip1后细胞增殖的变化,以明确TP53通过调控p27Kip1表达来影响SK-MES-1细胞周期和增殖。4.探讨TP53抑制p27Kip1蛋白表达的机制c-myc作为一种广谱癌基因参与包括肺鳞癌在内的多种肿瘤的发生发展。我们推测c-myc信号通路可能与TP53调控p27Kip1表达相关。为了阐明TP53调控p27Kip1表达的机制,本研究首先利用WB实验分别测定下调和过表达TP53后c-myc表达的变化;然后再通过测定干扰c-myc对p27Kip1表达的影响来明确TP53抑制p27Kip1表达是由c-myc介导的。5.探讨TP53调控p27Kip1核输出的机制我们前期研究发现,下调TP53表达,核内p27Kip1蛋白增加,提示TP53与p27Kip1的核输出密切相关,但其机制尚不清楚。CRM1是一个重要的核输出蛋白,参与多个肿瘤抑制因子的核外转运。据此,我们推测TP53可能通过调控CRM1表达来介导p27Kip1的核外输出。研究采用免疫荧光染色、核质分离和WB等技术测定下调TP53对CRM1蛋白表达和p27Kip1核内分布的影响来加以验证。研究结果1.Sanger测序显示SK-MES-1细胞p53基因存在215位点C→G和892位点G→T突变,为p53突变型细胞。2.在免疫组化检测的12例肺鳞癌组织标本中,有6例TP53阳性(阳性为p53突变体),p27Kip1阴性;另6例TP53阴性,p27Kip1阳性。si RNA下调SK-MES-1 p53表达后,p27kip1 m RNA和蛋白表达均显著增加;慢病毒载体过表达TP53后,p27kip1 m RNA和蛋白表达均显著降低。结果表明,TP53抑制p27Kip1的表达。3.流式细胞术Brdu摄入实验显示,下调TP53表达,SK-MES-1细胞G0/G1期细胞比例显著增加,S期细胞比例显著下降;CCK-8实验显示,下调TP53以及同时下调TP53和p27Kip1表达,SK-MES-1增殖能力显著降低。结果提示TP53至少是部分通过抑制p27Kip1表达来促进SK-MES-1细胞增殖的。4.下调p53表达,SK-MES-1细胞c-myc蛋白表达显著降低;过表达TP53,c-myc蛋白显著增加。此外,下调c-myc表达,SK-MES-1细胞p27Kip1蛋白表达显著增加。结果提示,TP53可能是通过激活c-myc信号来抑制p27Kip1的表达。5.下调p53表达,SK-MES-1细胞CRM1蛋白显著降低;WB和免疫荧光染色均显示细胞核内p27Kip1蛋白增加;结果提示,TP53可能是通过调控CRM1的表达来影响p27Kip1核分布。结论1.TP53通过激活c-myc信号通路抑制p27kip1来促进肺鳞癌细胞增殖;2.TP53上调CRM1表达促进p27kip1出核并与p27kip1表达下调协同作用,进一步促进肺鳞癌细胞增殖。