目的肿瘤抑素(tumstatin)是最新发现的来源于基底膜Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制因子,通过特异性结合αvβ3整合素受体选择性抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移,具有很强的生物学效应。内源性新生血管抑制剂进行肿瘤治疗具有不产生耐药性、无毒副作用以及广谱性,已成为目前肿瘤治疗的热点。tumstatin的研究和开发使其极有可能成为一种新的抗肿瘤药物。然而,tumstatin和其他内源性血管生成抑制剂一样,存在着许多诸如间接治疗只能减缓肿瘤生长、治疗周期长等需要解决的问题,因此,需要更好的解决方案改善tumstatin的抗肿瘤效应。在所有提出的改进方法中以多种血管生成抑制因子或血管抑制因子-抗肿瘤细胞药物的联合应用为现今治疗肿瘤的方向之一。在本研究中,我们利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的指示性能以及可在体内引发T细胞介导的细胞毒作用,用基因重组技术将全长tumstatin基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因构建tumstatin-EGFP的分泌型真核表达质粒,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞,建立稳定转染的CHO细胞系,分析融合蛋白tumstatin-EGFP在CHO中的表达,初步观察tumstatin-EGFP融合蛋白能否保持各自的生物学活性以及体外tumstatin能否携带与之融合的EGFP特异性结合血管内皮细胞。方法用重叠区扩增拼接法(SOEing)以pGEM-T/STL质粒和PEGFP-C2质粒为模板,用各自相应的引物分别扩增目的基因,获得STL-EGFP(sig-tum-EGFP)、sig-EGFP和sig-tumstatin基因片段,经酶切后将片段定向插入同样酶切的pIRESneo3质粒中。经酶切分析和测序验证正确的PIRESneo3/STL-EGFP、PIRESneo3/ sig-EGFP、PIRESneo3/sig-tumstatin重组质粒和空载体PIRESneo3分别与lipofectamine 2000混合,转染CHO细胞,用G418(700mg/l)连续筛选3次,获得稳定转染的细胞后,用RT-PCR和western blot检测tumstatin-EGFP的表达,倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。通过细胞增殖抑制试验、诱导内皮细胞凋亡和管状结构形成抑制试验评估融合蛋白tumstatin-EGFP的tumstatin样活性,体外靶向试验验证融合蛋白能否特异性结合内皮细胞。结果重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞中获得稳定表达,收集稳定转染的细胞进行RT-PCR,证实了tumstatin-EGFP基因整合入CHO细胞基因组DNA。倒置荧光显微镜下明显观察到了绿色荧光蛋白的表达,在明暗不同视野下对细胞进行计数,绿色荧光蛋白的表达率高达95%以上。用tumstatin多克隆抗体作为一抗,Western blot分析CHO- STL-EGFP重组细胞株培养上清液,检测到tumstatin-EGFP的表达,说明了培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,分子量约55ku,与先前设想的一致,表明了我们获得了稳定转染的CHO-STL-EGFP重组细胞株。通过生长曲线分析外源基因的导入对CHO细胞生长的影响,观察到转染后的CHO细胞较未转染的CHO细胞生长缓慢,可能由于外源基因的导入对细胞生长有一定的影响作用。内皮细胞增殖抑制试验、诱导内皮细胞凋亡试验和管状结构形成抑制试验证实了融合蛋白tumstatin-EGFP具有tumstatin样活性,并与tumstatin作用无显著差异。此外,体外血管内皮细胞靶向试验也验证了融合蛋白tumstatin-EGFP能够特异性结合内皮细胞。结论通过基因重组技术将两种不同的基因融合、表达产生一个具有双功能的分泌型融合蛋白tumstatin-EGFP,获得了以下结论①成功构建了分泌型融合蛋白tumstatin-EGFP的真核表达载体pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-EGFP。②重组表达载体pIRESneo3/sig- tumstatin-linker- EGFP在真核细胞CHO-K1中实现了分泌型表达。③Tumstatin与EGFP基因融合不影响EGFP的表达。也不影响tumstatin的表达和抗原性。④融合蛋白tumstatin-EGFP仍保留tumstatin的抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡的活性。⑤Tumstatin与EGFP基因融合仍然具有tumstatin的抑制血管管状结构形成的作用。⑥确定了在体外的tumstatin-EGFP靶向功能即tumstatin能够特异性携带与之相融合的EGFP蛋白靶向内皮细胞。本次研究结果为进一步的体内验证融合蛋白的生物活性、靶向性以及协同抗肿瘤效应等的实验研究提供试验依据并为tumstatin作用机制的探讨及其融合蛋白的研究奠定基础。