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小球藻是一种光合效率很高的单细胞真核绿藻,可作为生物反应器表达合成复杂蛋白质,形成有活性的分子。小球藻生长迅速、繁殖快,人工培养条件简单,生产成本较低,易于大规模培养。此外,小球藻油脂含量高,同时富含维生素、氨基酸、矿物质及蛋白质,是非常好的单细胞蛋白(SCP)来源,也因此被誉为21世纪人类绿色营养源。基于以上优点,小球藻在治理污水、生物柴油、饲料与食品、药用价值等方面具有广泛的应用前景。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-associated)是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。其中II型CRISPR/Cas免疫系统依赖于Cas9内切酶对外源DNA靶向剪切。CRISPR/Cas9系统因其构建相对简单、成本较低、精准度高、并且能对多个基因位点进行定点编辑等优势,现已成为研究热点。本研究通过测定小球藻生长曲线、比生长率、密度曲线,确立小球藻基因工程筛选标记等进一步把握了小球藻的生长特性,建立并优化了小球藻基因工程筛选标记及外源基因转化体系;选取了含Hygromycine基因的植物双元表达载体pCAMBIA 1302质粒,针对该质粒的Hygromycine基因设计了gRNA,并成功将该gRNA序列与带Cas9的质粒pRGE31构建重组质粒pRGE31-gRNA,采用电击的方法成功将质粒pCAMBIA 1302和pRGE31-gRNA转入小球藻中,获得瞬时表达,初步建立了小球藻培养及筛选,外源基因导入流程并且通过瞬时表达验证了CRISPR/Cas9能够在小球藻内具有切割功能。本研究成功建立了小球藻外源基因转化体系并且运用CRISPR/Cas9系统定点编辑了目标基因Hygromycine,在此基础上,我们将进一步建立并优化利用CRISPR/Cas9系统对小球藻进行基因组编辑的体系,来实现为小球藻的遗传育种及产业应用提供可靠的实验基础。