【摘 要】
：
芥蓝（Brassica olearcea var.chinensis Lei）属芸苔属,是我国华南地区特色蔬菜之一,具有很高的营养价值,含有丰富的硫代葡萄糖苷（Glucosinolate,简称硫苷）。硫苷是一种重要的植物次生代谢物质,参与植物抗逆、抗病虫等应激反应,其中的萝卜硫苷（RAA）有很强的抗癌作用。在硫苷合成的关键基因位点GS-AOP存在AOP2基因,该基因编码的蛋白酶催化4-甲基亚磺酰丁
论文部分内容阅读
芥蓝（Brassica olearcea var.chinensis Lei）属芸苔属,是我国华南地区特色蔬菜之一,具有很高的营养价值,含有丰富的硫代葡萄糖苷（Glucosinolate,简称硫苷）。硫苷是一种重要的植物次生代谢物质,参与植物抗逆、抗病虫等应激反应,其中的萝卜硫苷（RAA）有很强的抗癌作用。在硫苷合成的关键基因位点GS-AOP存在AOP2基因,该基因编码的蛋白酶催化4-甲基亚磺酰丁基硫苷（萝卜硫苷,RAA）转化为3-丁烯基硫苷（NAP）,NAP进一步转化为有害的2-羟基-3-丁烯基硫苷（PRO）。抑制BocAOP2基因的表达,有望创制出有益硫苷RAA含量高且有害硫苷PRO含量低的芥蓝新材料。本研究通过参考芥蓝基因组和转录组数据克隆得到3个BocAOP2s基因（BocAOP2a,BocAOP2b和BocAOP2c）,对其进行了序列和表达模式分析;在芥蓝中建立了CRISPR/Cas9基因编辑体系,并利用该体系对3个BocAOP2s进行定点编辑,以抑制该基因的表达。获得的主要研究结果如下:1.克隆了3个BocAOP2s基因及其启动子序列,分析了其序列特点（1）克隆得到三个基因的DNA和c DNA序列,BocAOP2a、BocAOP2b和BocAOP2c的CDS序列同源性达到87.21%,其中BocAOP2a和BocAOP2b相似性为93.21%;BocAOP2c比BocAOP2a和BocAOP2b分别缩短了51和52个氨基酸。（2）三个BocAOP2s属于2OG-FeⅡ＿Oxy基因家族,与拟南芥中AOP2类似,其编码蛋白具有典型的2OG-FeⅡ＿Oxy保守结构域,可能参与硫苷合成。三个基因与甘蓝、油菜、白菜的AOP2亲缘关系最近。（3）克隆得到BocAOP2a、BocAOP2b和BocAOP2c上游1587 bp、1591 bp和1406 bp的启动子区域序列。序列分析发现BocAOP2a启动子含有4个MYB结合位点,其中一个是光响应的MYB结合位点;BocAOP2b和BocAOP2c启动子含有3个MYB结合位点,其中BocAOP2c启动子含有一个黄酮类基因调节的MYB结合位点。2.分析了3个BocAOP2s的表达模式对BocAOP2s在不同组织部位、不同发育时期和不同处理条件下的表达模式进行了分析。BocAOP2a和BocAOP2b在各组织部位表达量均较高,尤其在花蕾或花薹外皮中表达量最高;随着植株的生长发育,3个BocAOP2s表达量逐渐上升,在果荚和种子中表达量最高;BocAOP2a和BocAOP2b在不同组织部位和不同发育时期表达量均高于BocAOP2c。伤害胁迫、低温处理和高温处理均能诱导根、茎和叶组织中三个基因上调表达;在响应不同胁迫的过程中,BocAOP2a和BocAOP2b的表达量较高,而BocAOP2c的表达量较低。以上结果表明BocAOP2a和BocAOP2b可能是关键的硫苷生物合成相关基因。3.芥蓝CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立选择白化标志基因BocPDSs作为靶基因,构建pCACas-t RNA-sgRNABocPDSs-ABCD基因编辑载体,转化芥蓝。PCR检测后,得到18株转基因植株,其中11株表现出易于识别的白化表型;对获得的转基因植株进行扩增区域的PCR产物测序,结果发现表现出白化表型的11株芥蓝植株都发生了基因突变,突变效率高达61.11%;其中BocPDSs基因序列出现了碱基缺失1次（7.69%）,碱基替换2次,（15.38%）,碱基插入8次（61.54%）,组合突变2次（15.38%）,说明CRISPR/Cas9基因编辑体系在芥蓝中成功建立。4.CRISPR/Cas9技术敲除芥蓝BocAOP2s基因构建了BocAOP2s的CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化芥蓝。经PCR检测后,获得15株转基因植株;对转基因植株BocAOP2序列区域的PCR产物进行测序,发现有5株转基因植株发生突变,突变效率达到33.33%;其中2株发生了碱基缺失,2株发生了碱基替换,1株发生了碱基插入。对这5株转基因突变植株进行BocAOP2s及其它硫苷合成相关基因表达水平的分析,其中4株突变植株BocAOP2s表达量显著下调,其下游硫苷合成基因BocODDs的表达量也显著下调,说明BocAOP2s的功能可能已经被抑制,影响了下游基因的表达,暗示BocAOP2s参与芥蓝硫苷生物合成;其上游调控转录因子MYB28、MYB29的表达在其中两株转基因突变植株中发生显著下调,说明BocAOP2s可能对MYB28、MYB29转录因子具有一定的反馈调控作用,但是具体分子机制还有待进一步研究。转基因植株的表型和硫苷组分与含量分析还在进行之中。
其他文献
火龙果（Hylocereus）是当前国内快速发展的一种新兴水果,果实外形奇特,颜色鲜艳,并且营养物质丰富,具有较高经济价值。可溶性糖的组成和含量是影响果实风味品质的重要因子之一,火龙果果实主要以积累单糖为主,果实不同部位的可溶性糖含量也存在差异,但目前对火龙果果实糖代谢及转运相关的调控机制研究较少。Dof转录因子是植物特有的一类转录因子,参与调控植物生长发育和次生物质代谢等多种生物学过程。然而,D
龙眼（Dimocarpus longan Lour.）又名桂圆,是我国南方主要的亚热带水果之一,主要种植在广东、广西和福建等地。龙眼成熟于夏季高温季节,极不耐贮藏,其果皮褐变是影响采后龙眼品质最突出的问题。目前,已有多种对于抑制采后龙眼果皮褐变处理的报道,其中,SO2熏蒸对于龙眼果皮的护色效果研究得比较透彻,在商业上应用也相当广泛。但由于SO2本身具有毒性以及硫残一直以来是消费者所担心的问题,商业
甜菜素是一种水溶性含氮天然色素,具有多种生物活性功能,在食品、化工、印染、日化、医药、饲料等领域中广泛的应用前景。目前,甜菜素生物合成途径中的结构基因在积累甜菜素的植物中已有较多报道,但关于其调控机制报道很少。MYB类和WRKY类转录因子在植物生长发育、生理代谢、抗逆反应和激素信号转导中发挥重要作用。火龙果果实中含有丰富的甜菜素,然MYB类和WRKY类转录因子如何调控甜菜素生物合成机制尚不清楚。本
香蕉是世界重要的热带与亚热带水果之一,是典型的冷敏型水果,香蕉果实在贮运过程中极易发生冷害,而冷害会严重影响并降低其商品价值。研究表明,bHLH类转录因子参与生物与非生物胁迫响应,并且冷害影响细胞膜脂含量以及组分,破坏细胞膜结构。前期研究发现,外源乙烯处理能够诱导香蕉果实耐冷性,但bHLH是否参与乙烯诱导的香蕉果实耐冷性,膜脂代谢在bHLH调控的香蕉果实耐冷性中的作用等了解较少。为此本研究选取了参
番木瓜（Carica papaya L.）是我国亚热带经济作物之一,营养及经济价值高。番木瓜是典型的呼吸跃变型果实,采后成熟快、易软化腐烂而不易保鲜,在贮藏和运输过程中损失严重。乙烯受体抑制剂1-甲基环丙烯（1-MCP）可有效延缓果实成熟和软化,但1-MCP处理不当容易引起番木瓜果实不正常软化,造成后熟障碍。因此研究1-MCP引起后熟障碍的分子机制,可为提高番木瓜贮藏保鲜技术提供理论参考依据。本研
辣椒（Capsicum spp.）又叫辛椒、辣子和番椒等。辣椒属于茄科辣椒属,是一种重要的蔬菜和加工调味品。辣椒素（Capsaicin）及其类似物简称辣椒素类物（Capsaicinoids）作为辣椒属植物特有的一种生物碱。辣椒素具有很高的应用价值,如运用在军事、医疗、食品和化工领域。发掘辣椒素生物合成关键基因,明确其作用机制是对辣椒素生物合成进行遗传改良的必要前提。本课题组前期通过筛选调控辣椒素生
番茄青枯病（Bacterial wilt）是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的,是世界范围内危害最严重的茄科植物病害之一。使用番茄抗病品种是防治青枯病最有效且环保的措施,而研究抗病机理可为病害防治及育种提供直接指导。番茄Solyc07g056190.2基因是本实验室前期从番茄抗、感材料分析得到的差异表达基因,本研究对其功能进行进一步研究。试验得到的主要结果如下:1
干旱是影响农业生产的主要自然灾难之一。我国是一个相对干旱的国家,由于极端干旱天气影响,广东省干旱区域增加。因此,开展植物抗旱机理研究以减少不良环境影响尤为重要。番茄是世界范围种植最广泛的蔬果类园艺作物之一,研究干旱胁迫对番茄的影响,有助于提高番茄的抗旱性和培育抗旱新品种,更好地应对全球性环境变化,从而更好地进行番茄生产,具有重要的经济效益。近年来,越来越多的研究关注胁迫下多种激素间的信号互作,以阐
随着社会发展和人们生活水平的逐渐提高,消费者对特色农产品品质的要求也越来越高,香芋南瓜因具有浓郁的香味特征,深受广大消费者的喜爱。因此,开展香芋南瓜香味性状的分子机理研究,对于调控香芋南瓜的香味和培育香芋南瓜新品种都具有重要的意义。本文以香芋南瓜312及非香芋南瓜18292的叶片为材料,基于气相色谱与质谱联用（GC-MS）技术获得挥发性化合物,利用主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归分析（PLS-
随着广东省冬作马铃薯种植覆盖模式从稻草转变为黑膜,施肥方式也从过去的“一次基肥多次追肥”（简称“一基多追”）变更为“一次基肥不再追肥”（简称“一基免追”）。该施肥方式存在常规肥料养分供应时期及供应量与马铃薯不同生育期对氮素需求不匹配的问题,因此,探究适宜于马铃薯各生育期养分需求的肥料供应就成为了新模式下拟解决的关键科学与实践问题。本研究以缓控释氮肥为切入点,在施用9000.0 kg·hm-2腐熟鸡