mTOR通路抑制剂GDC-0349对急性T淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞增殖和凋亡的作用及机制研究

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目的:急性T淋巴细胞白血病(Acute T lymphocytic leukemia,T-ALL)是骨髓内T淋巴细胞异常增殖的恶性肿瘤。尽管化疗缓解率可达80%,但仍有50%患者复发,因此急性T淋巴细胞白血病的治疗仍是一大难题,寻找高效及高特异性的治疗药物也成为近年来的研究热点。PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活可引起T细胞的分化异常以及白血病干细胞形成,从而诱导急性T淋巴细胞白血病的发生。GDC-0349是mTOR信号通路的ATP竞争性抑制剂,能阻断mTORC1和mTORC2活化,诱导细胞凋亡。目前GDC-0349在急性T淋巴细胞白血病中的作用尚未见报道。因此本研究的目的是明确GDC-0349对急性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM细胞的增殖和凋亡的影响及其作用机制。研究方法:1、急性T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM细胞培养;2、CCK8法检测0.1%DMSO和10、25、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞12、24、48及72h后CCRF-CEM细胞的增殖活性;3、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测0.1%DMSO和10、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后的细胞凋亡率;4、Western blot检测0.1%DMSO和10、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后凋亡相关蛋白Bcl2、Caspase3及Cleaved Caspase3的表达情况;5、Western blot检测0.1%DMSO和10、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后AKT/mTOR通路相关蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR及4EBP1的表达情况;6、统计方法:所有数据均以均数±标准差来表示。使用SPSS 22.0分析软件进行统计学分析,独立样本t检验分析两样本均数的差异,One-way Anova方法分析多组均数的差异,P<0.05认为具有统计学差异。结果:1、0.1%DMSO和10、25、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞12、24、48及72h后,结果显示GDC-0349对CCRF-CEM细胞增殖具有抑制作用,并呈时间剂量依赖性,组间比较具有显著差异(P<0.05);2、0.1%DMSO和10、25、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后,加入AnnexinⅤ-FITC/PI双染,应用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示GDC-0349促进CCRF-CEM细胞凋亡,并呈浓度依赖性。细胞凋亡率分别为(8.74±3.23)%、(13.84±2.48)%、(19.66±1.73)%及(35.98±5.87)%。各组的凋亡率与对照组比较均具有统计学差异(P<0.05);3、Western blot结果显示GDC-0349(浓度为10、50及100μM)促进细胞凋亡,随着浓度增加,凋亡蛋白Caspase3表达和抗凋亡蛋白BCL2逐渐减少,Cleaved Caspase3逐渐增多(P<0.05);4、Western blot结果显示CCRF-CEM细胞加入GDC-0349(浓度为10、50及100μM)培养48h后,AKT/mTOR通路相关蛋白AKT、mTOR、4EBP1及磷酸化蛋白p-AKT和p-mTOR均逐渐减少,呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:1、mTOR通路抑制剂GDC-0349能够抑制CCRF-CEM细胞增殖,并呈时间及浓度依赖性;2、mTOR通路抑制剂GDC-0349能够促进CCRF-CEM细胞凋亡,并呈浓度依赖性;3、mTOR通路抑制剂GDC-0349通过抑制AKT/mTOR通路相关蛋白的磷酸化来抑制CCRF-CEM细胞的增殖和促进其凋亡。
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