宫颈癌(Cervical Cancer)是全球女性第四常见的恶性肿瘤,在女性恶性肿瘤中发病率居第二位,每年528,000例妇女被确诊为宫颈癌,266,000例妇女死于宫颈癌。而发展中国家宫颈癌病例占全球总数的85%。在中国,宫颈癌的发病率为7.5/10万,死亡率为3.4/10万。宫颈癌已成为严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤之一。WAPL(wings apart-like)基因是1977年在果蝇体内发现的一个基因,定位于果蝇的X染色体2D5-2D5。在有丝分裂中,WAPL基因编码的蛋白质主要功能是管理异染色质结构,维持姐妹染色单体的黏合。WAPL基因的变异会妨碍姐妹染色单体的正常靠近和并列,但不影响染色单体各自的凝集和分离。WAPL基因在人体内的同源序列称为h WAPL(human wings apart-like)基因,长约30,793bp,定位于10q23.2。h WAPL蛋白是一种聚合锚定蛋白,和WAPL蛋白保守区域高度同源。h WAPL蛋白可以在有丝分裂前期使染色体臂的聚合适时解离。但h WAPL基因的过度表达,则会使得姐妹染色单体过早解离。h WAPL基因的高表达会导致细胞染色体断裂,有丝分裂中产生非整倍体或者多核细胞,导致染色体的不稳定性增加,从而扰乱有丝分裂,导致肿瘤发生。在对多种癌组织及癌细胞系的研究中发现,h WAPL基因仅在宫颈癌组织及细胞系中高表达,是宫颈癌的特异性高表达基因。在对正常宫颈上皮组织、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织和宫颈癌组织的研究中发现,随着宫颈病变的进展,h WAPL基因的表达逐步增强。h WAPL基因在宫颈癌的发生发展中起重要作用。h WAPL基因具有癌基因特性,h WAPL基因表达产物可能起S期检测点或者其他凋亡路径的作用。在宫颈癌细胞系中抑制了h WAPL基因的表达会导致细胞凋亡,而在动物实验中抑制了h WAPL基因的表达则会明显抑制肿瘤生长。同时hWAPL基因的多态性和宫颈癌易感性密切相关。Myc基因是癌基因,c-Myc是其家族的成员之一。人类c-Myc基因定位于染色体8q24区。c-Myc基因编码的蛋白质是一种具有DNA结合功能的核蛋白,在核内信息传递中起重要的作用。c-Myc蛋白在细胞胞浆内合成后,转移至细胞核内,与特异的DNA序列的CACGTG核心序列序列结合,激活或增强靶基因的转录和表达,促进细胞的增殖,同时也参与了肿瘤的发生和发展。c-Myc基因的功能包括,抑制细胞分化,促进细胞增殖,调节细胞周期,参与细胞调亡等。其表达产物是细胞周期由G0/G1向S期演进所必需的,它主要是通过影响各种细胞周期素启动细胞周期演进。在生理状况下,c-Myc基因的适度表达维持细胞的正常增殖和凋亡状态,维持细胞内环境稳定。c-Myc原癌基因如果被激活为癌基因,会使细胞脱离正常生长调节的限制并向恶性表型转化,并抑制细胞调亡。在正常细胞中,c-Myc的表达受到严密而且精细的调控,呈较低的水平表达。c-Myc基因与宫颈癌的发生发展密切相关。在宫颈癌组织中,c-Myc基因的阳性表达率明显高于正常宫颈组织。c-Myc基因的扩增和过度表达可能是宫颈癌发生中的早发事件。c-Myc基因表达程度随着宫颈病变的恶性程度增高而增强,而且宫颈癌组织及CIN3组织与CIN1组织及CIN2组织相比,c-Myc基因的表达明显增强。c-Myc基因表达程度,随着FIGO分期、病理学分级以及分化程度的升高而升高。c-Myc基因的表达可作为判断宫颈癌预后的一个重要指标。作为一个只在宫颈癌组织中特异性高表达的癌基因,h WAPL基因在宫颈癌的早期诊断、基因诊断和生物学治疗方面具有极其重要的意义。但h WAPL基因的调控机制、调控途径及其在宫颈癌中特异性高表达的原因并不清楚。h WAPL基因核心启动子定位、转录因子和信号转导途径等方面,国内外都无相关研究。本课题从h WAPL基因的调控机制入手,首先研究并明确h WAPL基因核心启动子的定位;而后根据h WAPL基因启动子所在区域,利用生物信息学方法对h WAPL基因转录因子进行预测。根据预测结果,选择c-Myc蛋白为研究对象,明确c-Myc蛋白是否具有转录激活活性;最后研究c-Myc蛋白是否能和h WAPL基因核心启动子所在区域结合,是否是h WAPL基因的转录因子。实验目的:1.研究并明确h WAPL基因核心启动子定位。2.研究c-Myc蛋白是否具有转录激活活性;3.研究c-Myc蛋白能否和h WAPL基因核心启动子所在区域结合,是否是h WAPL基因的转录因子。本实验研究内容共分三个部分:第一部分h WAPL基因核心启动子的定位目的研究并明确h WAPL基因核心启动子定位。方法应用荧光素酶检测实验。1)选取h WAPL上游-3000bp为研究对象,利用荧光素酶检测为研究方法进行分析将h WAPL上游-3000bp分成两段,分别是-2617—-1317bp和-1317—-1bp。2)分析步骤如下:构建载体,两段目的基因分别与p MD18-T载体的连接、转化并检测;构建融合表达载体p GL4.17,将目的基因插入luc2报告基因前面;去内毒素质粒提取;Lipofectamine 3000转染试剂转染细胞后进行荧光素酶活性检测。3)经分析,h WAPL基因核心启动子位于h WAPL基因上游-1317—-1bp区域内。4)将h WAPL基因上游-1317—-1bp区域分为三段,分别是-900—-1bp,-600—-1bp,-300—-1bp,分别利用荧光素酶检测实验进行分析,步骤同上。结果h WAPL基因核心启动子位于h WAPL基因上游-300—-1bp内。第二部分h WAPL基因转录因子的生物信息学预测和c-Myc蛋白转录激活活性的研究目的对h WAPL基因转录因子进行生物信息学预测,研究c-Myc蛋白是否具有转录激活活性方法根据h WAPL基因启动子所在区域,利用生物信息学方法对h WAPL基因的转录因子进行预测。根据FRANSFAC数据库的PWM预测算法、ENCODE数据的预测算法和JASPAR数据的预测算法等三种预测对h WAPL基因转录因子进行预测。选择三种预测结果交集中的c-Myc蛋白研究对象,验证c-Myc蛋白是否为h WAPL基因的转录因子。c-Myc蛋白转录激活活性的研究利用酵母双杂交的自激活实验。1)载体构建:构建c-Myc-p GBKT7载体;2)准备酵母细胞AH109感受态细胞;3)p GBKT7载体和p GADT7载体共转化酵母菌株AH109,克隆至SD/–Leu/–Trp,挑取克隆至SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp培养基上培养;4)X-gal检测实验,将四缺SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp培养基平皿上的克隆转接到新的含有X-gal的选择性四缺培养基上,观察克隆是否变蓝。结果1)在三种预测结果的交集中,c-Myc蛋白是h WAPL基因的转录因子之一。2)酵母双杂交结果显示所有共转BD和AD载体的Y187菌株在二缺培养基上都长出了克隆,说明共转化成功。3)将SD/–Leu/–Trp培养基上的克隆挑取至SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp培养基平皿中培养发现,除了共转化阴性对照组未长出克隆外,其余实验组别均长出克隆。4)将SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp上的克隆挑取至含有x-gal的SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp上培养发现克隆有变蓝,此实验结果说明c-myc蛋白有自激活活性。第三部分c-Myc蛋白和h WAPL基因核心启动子的关系研究目的研究c-Myc蛋白能否和h WAPL基因核心启动子所在区域结合,是否是h WAPL基因的转录因子方法应用酵母单杂交实验。1)构建c-Myc-p GADT7和h WAPL-p HIS2载体;2)准备酵母Y187感受态细胞;3)p GADT7和p HIS2共转化酵母菌株Y187,克隆至选择性的SD/-Trp-Leu-His并在加有3-amino-1,2,4-triazole(3-AT)的营养缺陷型培养基上培养;4)酵母单杂交,将c-Myc-p GADT7和h WAPL-p HIS2质粒共转化酵母菌Y187,观察酵母细胞能否在SD/-Trp-Leu-His并在加有3-amino-1,2,4-triazole(3-AT)的营养缺陷型培养基上生长。结果1)酵母双杂交结果显示所有共转p HIS2和AD载体的Y187菌株在二缺培养基上都长出了克隆,说明共转化成功。2)将SD/–Leu/–Trp培养基上的克隆挑取至SD/–His/–Leu/–Trp(含20m M的3-AT)平皿中培养发现,所有实验组别都正常长出克隆,说明20m M的3-AT不足以抑制实验组的组氨酸表达;3)将3-AT含量进一步加大到40m M,将克隆挑取至SD/–His/–Leu/–Trp(含40m M的3-AT)平皿中培养发现,除了阳性对照组可以正常长出克隆外,其余组别均未长出克隆,此实验结果说明c-Myc蛋白和h WAPL基因的核心启动子并不存在结合情况。结论1.h WAPL基因核心启动子位于h WAPL基因上游-300—-1bp内。2.c-Myc蛋白具有转录激活活性。3.c-Myc蛋白不能和h WAPL基因核心启动子所在区域结合。4.c-Myc蛋白不是h WAPL基因的转录因子。