作为生物体结构和功能基本单位的细胞，是由蛋白质、脂类、核酸等非常复杂的动态分子网络所构成。在细胞中，每个蛋白分子都具有其独特的行为和功能特征，比如信号转导、基因表达、能量代谢、物质运输等。在单细胞、单分子水平研究细胞内生物分子的基本生物学功能、与其它分子的相互作用以及时间空间的动力学特征等，具有重要意义。近些年发展起来的单分子荧光成像技术为我们对生物分子的深入研究提供了有效的途径。全内反射荧光成像技术作为单分子荧光技术的一种，可以原位实时动态观察活细胞膜上的单分子行为，已成为探究细胞膜区生命过程的重要工具。　　β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,β2AR)是GPCR家族中典型的一员，它调控机体的诸多生理过程，尤其在心血管功能调节中起着极为重要的作用，是多种药物的作用靶点。深入研究β2AR信号转导通路在理论和临床方面均具有重要意义。不同配体与β2AR结合，可以分别激活细胞内的G蛋白或β-arrestin介导的信号通路，从而产生不同的生物学效应:儿茶酚胺类激动剂与β2AR结合所激活的G蛋白信号通路为β2AR的经典信号通路，但该信号通路的持续激活会带来一定的心脏毒性;最近发现一些传统意义上G蛋白信号通路的拮抗剂（如Carvedilol等）具有偏向激活效用，即在有效阻断G蛋白信号通路的同时却能够选择性激活β-arrestin所介导的信号通路，呈现出一定的心脏保护作用。深入理解β-arrestin信号通路的偏向激活将会有利于新一代选择性抗心血管疾病药物的研制。　　对于许多细胞膜受体，配体刺激引发受体在细胞膜上的聚集是启动信号通路的第一步。对β2AR两条不同信号通路的研究可从偏向配体与非偏向配体刺激后受体在细胞膜上的聚集状态差异人手。而已有的研究报道对于静息状态下β2AR自身到底是以单体还是二聚体或多聚体的形式存在并没有得到一致的结论，配体刺激是否会影响β2AR的聚集状态更是存在争议。已有的结论基本都是在受体过量表达的情况下利用离体的生物化学技术得到的，而活细胞中受体的真实聚集状态以及配体刺激对其影响仍不清楚。　　在本课题中，我们利用活细胞全内反射荧光显微成像技术，通过控制受体的低表达量，在单分子水平原位研究β2AR在偏向配体与非偏向配体刺激前后的聚集状态以及与下游分子β-arrestin的相互作用。主要内容如下:　　1.利用单分子荧光成像，研究了β2AR在活细胞细胞膜上的聚集状态。发现在低表达量条件下，β2AR主要以单体形式存在于细胞膜上，偏向激动剂Carvedilol和ICI118551在激活β2AR下游ERK1/2信号通路的同时会诱导细胞膜上β2AR的二聚化。而完全激动剂Isoproterenol和拮抗剂Propranolol却不会对细胞膜上β2AR的聚集状态产生影响。　　2.研究了细胞中敲减β-arrestin1/2对β2AR二聚化的影响。我们通过在细胞中转染靶向siRNA对β-arrestin1/2进行有效敲减后，进一步研究了不同配体刺激下β2AR的聚集状态。结果发现用偏向配体Carvedilol刺激敲减β-arrestin1的细胞后，β2AR二聚化的增多比例相对未敲减细胞明显降低，而刺激敲减β-arrestin2的细胞时β2AR二聚化程度不再增高。表明偏向配体Carvedilol诱导细胞膜上β2AR的二聚化需要β-arrestin分子的参与，尤其是β-arrestin2。而用ICI118551刺激敲减β-arrestin1/2的细胞后，β2AR二聚化的增高比例与敲减前的细胞并无差异，表明ICI118551诱导细胞膜上β2AR的二聚化时不依赖于β-arrestin分子。　　3.研究了β2AR二聚体和β-arrestin分子在细胞膜上的相互作用。采用不同的荧光蛋白及荧光染料分别对β2AR和β-arrestin分子进行标记，然后通过多色全内反射荧光显微镜对不同标记的β2AR和β-arrestin进行单分子荧光成像。我们发现静息状态下β-arrestin主要弥散分布在细胞质中，完全激动剂Isoproterenol和偏向激动剂Carvedilol刺激后被招募上膜，并与β2AR发生共定位。并且，Carvedilol刺激下β-arrestin与细胞膜上β2AR二聚体的共定位比例明显高于Isoproterenol刺激的情况，表明β-arrestin信号通路的偏向激活可能需要β2AR的二聚化。这与Carvedilol刺激诱导细胞膜上β2AR二聚体增多的结论相一致。　　总之，利用高灵敏度的单分子荧光成像技术，我们研究了活细胞中低表达量的β2AR在细胞膜上的聚集状态，不同配体（完全激动剂、偏向激动剂和拮抗剂）对其聚集状态的影响及与下游分子β-arrestin的相互作用，从而发现了β2AR二聚体增加与β-arrestin信号通路偏向激活的联系，提出了β-arrestin介导β2AR的二聚化从而产生偏向激活效应的可能机制。