透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为一种高分子量的黏多糖,广泛存在于脊椎动物细胞中,发挥着结构、信号传导和信号识别的功能。HA由于其优异的黏弹性、保湿性和支撑作用,被广泛的应用于医药、化妆品、药物传递系统、疫苗和功能健康食品。目前,工业上主要经由革兰氏阳性C型链球菌如兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)发酵生产。但作为生产菌株,链球菌生长速度慢、培养基成本高等劣势日益显现出来,而寻找新的优秀野生生产菌株的希望渺茫。所以,利用基因工程构建合成HA的工程菌株不但有利于克服链球菌作为发酵生产HA菌株的劣势,而且对提高HA的品质,扩大HA的应用范围具有理论意义和应用价值。乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)作为革兰氏阳性菌的模式生物,已被广泛应用于食品发酵生产中,且被认定为GRAS(generally regarded as safe)微生物。乳酸乳球菌由于其自身的优良特性,正越来越多地被应用于代谢工程改造过的现代工业中。在过去的25年中,乳酸乳球菌的基因操作方法日益成熟,其中一系列的诱导表达启动子得到了深入的研究,并已开始应用于工业生产。通过改变小肽、单糖的浓度或诱导温度等调控因子,这些启动子能够实现乳酸乳球菌工程菌株中目的蛋白的可控表达。NICE(the nisin controlled gene expression)系统是乳酸乳球菌中研究最深入和最有效的基因工程操作系统之一,已被广泛地应用于该菌株的代谢工程改造。不但诱导剂乳酸链球菌素(nisin)是一种理想的高效安全无毒的食品级诱导分子,而且在NICE系统中可以将染色体上lacF基因缺失的乳酸球菌菌株以及含有lacF基因的质粒结合使用,用食品级筛选标记lacF替代抗生素抗性基因,构建食品级表达系统,而且该方式构建的工程菌株遗传稳定(deRuyter,Kuipers & de Vos,1996b;Mierau & Kleerebezem,2005a;Zhang,Chen,Jia,Chen & Huan,2002)。为了改善现有HA生产菌株的不足,我们计划利用该系统构建既具有合成HA能力的,同时符合公认安全标准的乳酸乳球菌工程菌株。另外,来源于乳糖操纵子PlacR的启动子也是乳酸乳球菌常用的强诱导表达启动子之一。LacR的启动子和NICE系统中nisA启动子已有利用各自诱导剂浓度的变化在乳酸乳球菌工程菌株中成功实现内源或外源蛋白可控表达的先例。这些特点有助于在本论文中实现乳酸乳球菌工程菌株中szHasA和szHasB基因的可控表达,从而在不同诱导条件下改变兽疫链球菌HAS与UDP-葡萄糖脱氢酶之间表达水平比率,为微生物合成HA分子量调控机制的研究提供了可能。HA在细胞内的合成是一个复杂的过程,有多种酶共同参与。在兽疫链球菌的HA合成途径中,包括透明质酸合酶(szHasA)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(szHasC)、UDP-葡萄糖脱氢酶(szHasB)、磷酸葡萄糖异构酶、氨基转移酶、乙酰基转移酶、变位酶和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(szHasD)。其中透明质酸合酶(HA synthase,HAS)是HA合成途径中的关键酶,具有利用UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)和UDP-N-乙酰-D-氨基葡糖(UDP-GlcNAc)合成HA的催化活性。UDP-葡萄糖脱氢酶(szHasB)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(szHasC)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(szHasD)是参与HA底物合成的酶类,通过一系列催化反应,分别将葡萄糖转化为UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc(Blank,Hugenholtz & Nielsen,2008)。在乳酸乳球菌中,也存在着与szHasB和szHasD相同催化活性的UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-GlcDH)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(LACR),分别由乳酸乳球菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因(ugd)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶基因(LACR)编码。本论文分别将基因szHasA、szHasB和szHasC的ORF重组于NICE表达载体pNZ8148的PnisA启动子调控之下,得到含有pSH71来源复制起始位点的表达载体pNZ8148-szHasA、pNZ8148-szHasB和pNZ8148-szHasC。将含有质粒pNZ8148-szHasA、pNZ8148-szHasB、pNZ8148-szHasC和pNZ8148-szHasABC的乳酸乳球菌工程菌株分别命名为N9000-A、N9000-B和N9000-C。通过重组表达载体pNZ8148-szHasABC和pNZ8149-szHasABC将兽疫链球菌来源的HA合成操纵子分别导入乳酸乳球菌NZ9000和NZ3900,得到工程菌株NFHA01和NFHA03。同时,通过融合PCR方法得到一个重组HA合成操纵子,命名为rHAop,在该DNA片断中,原兽疫链球菌HA合成操纵子中的szHasB和szHasC基因的ORF分别被乳酸乳球菌来源的ugd和LACR基因的ORF所取代。重组HA合成操纵子rHAop通过重组表达载体pNZ8149-rHAop导入乳酸乳球菌NZ3900中,得到工程菌株NFHA03。RIA法测定各工程菌株诱导后发酵液中HA的浓度。空白对照菌株NZ9000和分别单独表达szHasB、szHasC的工程菌株NZ9000-B和NZ9000-C的发酵液中没有检测到HA的合成,而工程菌株NZ9000-A发酵液中含有0.22 g/L的HA。证明乳酸乳球菌本身不具有合成HA的能力,而在该菌中单独表达HAS可以使工程菌株获得合成HA的能力,而且该菌本身具有HA底物UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的合成途径。工程菌株NFHA01的发酵液中含有0.6 g/L的HA,这一数据约为NZ9000-A发酵液中HA浓度的2.7倍,这一结果证明虽然乳酸乳球菌具有合成UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的能力,但自身合成的HA底物的不足限制HAS在工程菌株中合成高浓度的HA,而提高工程菌株HA底物的浓度,有助于HA合成能力的提高。工程菌株NFHA03和NFHA02发酵液中HA的浓度分别为0.49 g/L和0.38g/L,前者大约高出后者33%。证明在乳酸乳球菌工程菌株中重组表达异源szHasA,同时超表达同源UDP-GlcDH和LACR较同时表达外源szHasA、szHasB和szHasC更利于HA的合成。本论文利用lacF基因作为食品级筛选标记和NICE表达系统,构建得到一株不产生荚膜的具有食品级HA合成能力的工程菌株,而食品级HA在保健食品、医药产品和化妆品的应用中具有明显的优势。HA的相对分子质量(Mr)一般分布在10~4 Da-10~7 Da范围内。研究表明,在细胞和组织中,HA生物活性与糖链长度相关,不同Mr的HA具有不同甚至相反的生理或药理作用,HA的多种生物活性具有Mr依赖性。通过差异表达HA合成相关酶类,脊椎动物具有在体内调控HA Mr的能力。而目前微生物发酵生产的HA是Mr从大到小的一系列糖链的组合。因此,在活体微生物中确定HA的Mr调控机制并且建立制备特定Mr或特定Mr范围分布的HA的方法,不但具有重要的理论意义,而且对扩展HA的应用范围、改良含HA产品的质量具有应用价值。体外实验已证明,合成能力与底物浓度的比率是影响HA Mr的主要因素之一,我们认为这一理论同样适用于活体微生物内。为实现乳酸乳球菌工程菌株中HA合成能力与底物浓度的比率的可控调节,本论文构建了一个双质粒的调控表达系统,包括表达szHasA的载体pNZ8148-szHasA和表达szHasB的载体pNZ9531-szHasB,而这两个质粒可共存于同一株乳酸乳球菌中。pNZ8148-szHasA包含有乳酸乳球菌常用载体pSH71的复制起始位点,而szHasA基因位于NICE系统启动子nisA的调控之下:而另一个载体pNZ9531-szHasB则含有另一个乳酸乳球菌常用载体pAMb1所携带的复制起始位点,同时szHasB基因的诱导表达受到lacR启动子的调控。蛋白表达结果证明在工程菌株NFHA04中,借助pNZ8148-szHasA和pNZ9531-szHasB组成的双质粒调控表达系统,实现了不同诱导条件下改变szHasA与szHasB之间表达水平比率的实验目的。szHasA和szHasB mRNA拷贝数之间的比率,表征着HA合成能力与HA底物合成能力之间的相对强弱。不同诱导条件下,分析szHasA/szHasB mRNA比率对乳酸乳球菌工程菌株NFHA04合成HA的重均分子量((?)w)的影响,在微生物体内证明了HA合成能力与底物合成能力之间的相对强弱具有调控HA(?)w的作用。当代表HAS和UDP-GlcDH之间相对强度的szHasA/szHasB mRNA比率高时,发酵液中HA的(?)w相对较小,而当szHasA/szHasB mRNA比率减小时,(?)w则变大。分析认为,合成HA能力与合成HA底物能力之间的相对强弱是影响微生物HA Mr的重要因素之一,szHasA和szHasB mRNA拷贝数之间的比率高时,活细胞体内每一个HAS分子能够分配到的用来合成HA的底物就相对较少,则每一个HAS分子能够合成的HA糖链就相对较短,从而造成合成的HA的(?)w就较小:而当这一比率降低时,每一个HAS分子就有相对较多的底物分子可以用来合成HA糖链,从而造成合成的HA的糖链较长,(?)w也变大。这一理论的确定,为通过调节微生物体内HAS的表达水平和底物浓度来控制微生物生产过程中发酵液中HA Mr特性提供了切实可行的解决方案,具有重大的理论意义和潜在应用价值。本论文的主要内容:(1)通过NICE系统,将兽疫链球菌HA合成代谢途径相关基因导入乳酸乳球菌,构建一系列工程菌株。分析各工程菌株合成HA的浓度,证明利用代谢工程手段在乳酸乳球菌中引入编码HAS的基因,可以该菌株获得利用葡萄糖合成HA的能力。但自身合成的HA底物的不足限制HAS在工程菌株中合成高浓度的HA,而提高工程菌株HA底物的浓度,有助于HA合成能力的提高。(2)通过融合PCR方法得到一个重组HA合成操纵子,利用lacF基因作为食品级筛选标记和NICE表达系统,将该重组HA合成操纵子导入乳酸乳球菌,实现在同一株工程菌株中重组表达异源szHasA,同时超表达同源UDP-GlcDH和LACR,表达这三个合成HA关键酶的乳酸乳球菌工程菌株具备了合成食品级HA的能力。(3)构建了一个双质粒的调控表达系统,包括表达szHasA的载体pNZ8148-szHasA和表达szHasB的载体pNZ9531-szHasB中。在工程菌株NFHA04中实现了不同诱导条件下改变szHasA与szHasB之间表达水平比率的实验目的。(4)不同诱导条件下,分析szHasA/szHasB mRNA比率对乳酸乳球菌工程菌株NFHA04合成HA的重均分子量((?)w)的影响。证明合成HA能力与合成HA底物能力之间的相对强弱是影响微生物HA Mr的重要因素之一,szHasA和szHasB mRNA拷贝数之间的比率高时,活细胞体内每一个HAS分子能够分配到的用来合成HA的底物就相对较少,则每一个HAS分子能够合成的HA糖链就相对较短,从而造成合成的HA的(?)w就较小;而当这一比率降低时,每一个HAS分子就有相对较多的底物分子可以用来合成HA糖链,从而造成合成的HA的糖链较长,(?)w也变大。本论文主要创新点:(1)首次通过融合PCR方法得到重组HA合成操纵子。并首次在同一乳酸乳球菌工程菌株中实现了重组表达异源szHasA,同时超表达同源UDP-GlcDH和LACR。(2)首次利用lacF基因作为食品级筛选标记和NICE表达系统,在乳酸乳球菌终建立了透明质酸合成途径。该乳酸乳球菌工程菌株具备合成食品级HA的能力。(3)首次在乳酸乳球菌工程菌株中实现了兽疫链球菌HAS与UDPGlcDH的同时诱导可控表达。(4)首次在活体微生物体内证明HA合成能力与底物合成能力之间的相对强弱具有调控HA(?)w的作用。这一理论的确定,为通过调节微生物体内HAS的表达水平和底物浓度来控制微生物生产过程中发酵液中HA Mr特性提供了切实可行的解决方案,具有重大的理论意义和潜在应用价值。