Rev-erbβ是核受体Rev-erbs家族成员之一,在机体许多组织、细胞中均有表达,在骨骼肌、大脑、肾、肝脏和脂肪中表达水平较高。Rev-erbβ是机体重要的转录调节因子,广泛参与昼夜节律、代谢、炎症以及癌症等生理、病理过程。新近研究发现在一些肿瘤细胞中,Rev-erbβ的表达量明显增高于Rev-erbα。这些研究提示Rev-erbβ可能在肿瘤发生、发展过程中具有重要功能,但到目前为止,这方面的研究还相对较少以及分子调控机制仍还不清楚。PGRN是本实验室研究多年的一个具有多种功能的生长因子,它也广泛参与机体代谢、炎症和肿瘤等生理、病理过程。实验室前期在酵母双杂交筛库时筛选出Rev-erbβ与PGRN具有相互作用。因此,为了进一步验证Rev-erbβ和PGRN是否真正具有相互作用以及探索它们共同参与机体代谢、炎症及肿瘤等生理、病理过程的分子机理。本课题开展的研究内容如下:(1)Rev-erbβ单克隆抗体制备与鉴定:考虑到目前市场上针对人源Rev-erbβ的商业化抗体存在效价低,特异性差,且难以满足内源性Rev-erbβ的检测和免疫沉淀(IP)、染色质免疫沉淀(ChIP)等实验研究。本课题通过单克隆抗体的制备技术,成功制备出5株分别针对Rev-erbβ四个不同结构域的单克隆抗体(即抗体38E6针对Rev-erbβ-A/B结构域,抗体40H8/40D8针对Rev-erbβ-C结构域,抗体37H8针对Rev-erbβ-D结构域,抗体39C5针对Rev-erbβ-E结构域)。通过一系列分析和验证实验得知,所制备的5株单克隆抗体不仅可以特异识别Rev-erbp不同的结构域,而且这些抗体可用于识别或检测内源性Rev-erbβ蛋白质、Western blot、免疫荧光细胞染色、IP以及ChIP等实验研究。(2)Rev-erbβ与PGRN相互作用的验证:在实验室前期研究的基础上(用人源PGRN为诱饵蛋白初步筛选出的Rev-erbβ,可能是与PGRN发生相互作用的候选分子)。实验通过酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术和GST-pulldown结合实验来进一步验证PGRN与Rev-erbβ存在有直接的相互作用。通过共聚焦显微镜研究PGRN与Rev-erbβ在CHO细胞中的共定位情况,结果表明Rev-erbβ可以介导PGRN由细胞质向细胞核的转移,并与PGRN在细胞质和细胞核内形成颗粒状的共定位分布。(3)PGRN介导Rev-erbβ对靶基因表达调控的分子机制研究:由于核受体Rev-erbβ是机体重要的转录因子,为了验证PGRN对Rev-erbβ转录作用的影响,本实验构建了 GAL4-BD-Rev-erbβ-E融合蛋白载体和GAL4-UAS-CMV-Luci荧光素酶报告基因检测系统。为了检测PGRN与Rev-erbβ相互作用对Rev-erbβ靶基因调控的影响,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建了PGRN和Rev-erbβ双敲除的HEK293细胞系。将PGRN质粒与荧光素酶报告基因检测系统中的两个质粒GAL4-BD-Rev-erbβ-E 和 GAL4-UAS-CMV-Luci 共转染到 HEK293 细胞中,发现PGRN可以增强GAL4-BD-Rev-erbβ-E对GAL4-UAS-CMV启动子的抑制作用。在PGRN和Rev-erbβ双敲除的HEK293细胞系中,发现PGRN可以增强Rev-erbβ对外源靶基因启动子(hBmal1/hApoCⅢ/Srebp-1cpromoter)活性的转录调节作用,同时还证实PGRN和Rev-erbβ结合可以导致细胞中内源Rev-erbβ靶基因Bmal1 mRNA表达水平显著下降。(4)在肝癌HepG2细胞中初步研究Rev-erbβ的生物学功能:考虑到Rev-erbβ相互作用分子PGRN在肿瘤组织、细胞呈现高表达,并具有促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭等生物学功能。本研究以Rev-erbβ基因敲除HepG2和慢病毒感染过表达Rev-erbβ基因的HepG2细胞系为模型,初步研究了 Rev-erbβ对肿瘤发生、发展的影响。综上所述,本课题研究获得了以下结果:(1)成功制备了 5株针对Rev-erbβ不同结构域的单克隆抗体。(2)通过酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术和GST-pull down等实验手段证实Rev-erbβ与PGRN两者存在有直接的相互作用,并确定了Rev-erbβ和PGRN相互作用的结合部位分别是PGRN的BAC区域和Rev-erbβ-E结构域。(3)PGRN对Rev-erbβ靶基因转录调控影响研究结果表明,PGRN与Rev-erbβ结合,可以协同Rev-erbβ对靶基因转录进行转录调控作用。(4)Rev-erbβ生物学功能研究结果表明,在HepG2细胞中Rev-erbβ不仅具有抑制脂肪形成的作用;而且还可抑制HepG2细胞增殖、迁移及侵袭等肿瘤发生、发展过程。总之,以上这些研究结果为探讨Rev-erbβ与PGRN在肿瘤细胞中可能存在共同调节的分子机制和信号通路提供坚实的研究基础。