研究背景:帕金森病是临床上较为常见的神经退行性疾病。帕金森病的病因和发病机制较为复杂。其主要病理学特征是中脑黑质区致密部多巴胺能神经元的缺失和α-突触核蛋白堆积造成路易小体沉积,大多认为其与线粒体功能障碍、氧化损伤、神经炎症、细胞自噬障碍等有关。miRNA是高度保守的内源性非编码单链RNA,能够在转录水平抑制靶基因的表达,参与调节生长发育、炎症、凋亡等机体内几乎所有的生理病理过程。研究表明,多种miRNA在神经系统中表达丰富,其表达异常与帕金森病的发生发展密切相关,miR-124和miR-146a在神经系统中高度表达,在胶质瘤、脑脊髓炎和缺血性脑损伤等神经系统疾病中发挥着重要作用。但目前关于miR-124和miR-146a与帕金森病的相关性及其表达变化在帕金森病中的作用机制尚不清楚。第一部分miR-124和miR-146a在帕金森病小鼠模型及神经细胞中的表达目的:检测miR-124和miR-146a在帕金森病模型小鼠中脑组织及神经细胞中的表达。方法:腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)构建帕金森病模型小鼠。采用RT-PCR检测注射后不同时间点小鼠中脑组织中miR-124和miR-146a的相对表达量。免疫荧光染色联合RNA原位杂交技术检测miR-124和miR-146a小鼠中脑组织的多巴胺能神经元和小胶质细胞中的表达强度。QRT-PCR分别检测不同浓度1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理SH-SY5Y细胞中miR-124的表达和不同浓度脂多糖(LPS)处理的BV2细胞中miR-146a的表达。结果:与对照组相比,不同时间点的MPTP帕金森病小鼠中脑组织内miR124的表达显著降低,而miR-146a的表达显著升高;免疫荧光联合RNA原位杂交结果发现,MPTP帕金森病小鼠的中脑多巴胺能神经元明显减少,miR-124表达强度减弱;小胶质细胞被活化,miR-146a的表达强度增加;与对照组相比,MPP~+处理的SH-SY5Y细胞中miR-124的表达均显著降低(P<0.05),而LPS处理的BV2细胞中miR-146a的表达升高。结论:miR-124在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中的表达下调;LPS处理的BV2细胞中miR-146a的表达上调;本研究首次发现在MPTP诱导的帕金森病模型小鼠脑组织中,miR-124的表达降低,而miR-146a的表达升高,可能是帕金森病早期诊断潜在的生物标记物。第二部分miR-124和miR-146a的靶基因的预测及鉴定目的:分析miR-124和miR-146a的靶基因。方法:采用TargetScan、miRDB、Microrna.org软件和双荧光素酶报告基因实验预测并验证miR-124和miR-146a的靶基因;分别将miR-124模拟物(miR-124-mi),阴性对照(miR-124-NC),miR-146a模拟物(miR-146a-mi)和阴性对照(miR-146a-NC)转染至SH-SY5Y细胞,qRT-PCR和Western blot检测细胞中Bim或IRAK1的mRNA和蛋白的表达水平。结果:miR-124-mi能够抑制Bim-WT的荧光素酶活性,miR-146a-mi能够抑制IRAK1-WT的荧光素酶活性,Bim基因和IRAK1基因可能分别是miR-124和miR-146a的靶基因。miR-124-mi组中Bim基因mRNA和蛋白的表达水平均显著低于对照组和miR-124-NC组;miR-146a-mi组中IRAK1基因mRNA和蛋白的表达水平与升高,明显高于对照组和miR-146a-NC组。结论:miR-124和miR-146a分别靶向调控Bim和IRAK1基因。第三部分 miR-124和miR-146a参与帕金森病发生的作用机制目的:探究miR-124通过调节靶基因Bim发挥其神经保护作用及其相关机制;miR-146a通过靶向调控IRAK1的表达,参与神经炎症的可能机制。方法:侧脑室置管分别注射miR-124激动剂或阴性对照剂,miR-146a抑制剂或阴性对照剂,2天后腹腔注射MPTP,建立帕金森病小鼠模型:miR-124激动剂组、miR-124-NC组,miR-146a抑制剂组、miR-146a-NC组。只进行侧脑室注射,不进行腹腔注射MPTP的小鼠为对照组。qRT-PCR分别检测小鼠中脑组织中Bim和IRAK1 mRNA的表达,Western blot检测Bim、Puma、Noxa、Bid、Bax,IRAK1、NF-κB的表达。ELISA检测促炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的含量。采用TUNEL染色联合TH免疫组化实验检测脑组织中神经元的凋亡情况;结果:与对照组小鼠相比,MPTP帕金森病模型小鼠中Bim基因mRNA和蛋白的表达水平升高,且miR-124激动剂组明显低于miR-124-NC组;MPTP帕金森病模型小鼠中Bid和线粒体Bax蛋白表达上调,但miR-124激动剂组中的Bax水平明显低于miR-124-NC组;各组中Puma、Noxa表达无明显差异;与对照组小鼠相比,MPTP帕金森病模型小鼠中IRAK1基因的mRNA和蛋白的表达水平均降低,且miR-146a抑制剂组显著高于miR-146a-NC组;与对照组小鼠相比,MPTP帕金森病模型小鼠中NF-κB明显被激活,促炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的水平升高,但在miR-146a抑制剂组和miR-146a-NC组中无明显差异;MPTP帕金森病模型小鼠中神经元的凋亡率显著高于对照组,miR-124激动剂组神经元凋亡率明显低于miR-124-NC组,而miR-146a抑制剂与miR-146a-NC组中神经元的凋亡率无明显差异;结论:在MPTP帕金森病小鼠中,miR-124上调能够减轻MPTP诱导的神经元凋亡,抑制Bim的表达并减少下游凋亡蛋白Bax转位到线粒体内,抑制线粒体介导的内源性细胞凋亡;本研究首次发现抑制miR-146a的表达能够升高脑组织中IRAK1的表达,但对脑组织神经元的凋亡,NF-κB的激活及TNF-α、IL-1和IL-6炎性因子的表达无明显影响,提示miR-146a可能参与帕金森病中神经炎症的调节。全文结论本研究首次详细探究了miR-146a在帕金森病脑组织中的表达,初步揭示在MPTP诱导的帕金森病小鼠脑组织中,miR-124的表达下调,miR-146a的表达上调,可能是帕金森病早期诊断的生物学标志物。通过侧脑室注射进行体内实验,发现miR-124通过抑制靶基因Bim的表达,减少下游凋亡蛋白Bax的线粒体转位,介导的神经元凋亡而发挥神经保护作用,参与帕金森病的发生发展。首次分析miR-146a在帕金森病模型的作用:miR-146a能够抑制靶基因IRAK1的表达,可能参与帕金森病进程中神经炎症的调节。