肺癌是严重威胁人类健康的恶性疾病之一，无论是发病率还是死亡率均居恶性肿瘤前列。它的发生是多基因、多阶段、多因素相互作用的结果。参与肺癌发生过程的多种基因在肺癌和正常组织中的表达存在明显的差异，发现和研究这些肺癌差异表达基因有助于揭示肿瘤发生发展的分子机制，又可以为肺癌的诊断、预后以及治疗提供新的标志物和靶点。rap2b是最近运用抑制性消减杂交技术从中国人肺鳞癌高表达文库中筛选出的一个基因，其在文库中存在4个独立的EST克隆，染色体定位于3q25.2。既往研究显示多种肿瘤3q24—3q26区域出现高扩增，此区域为肿瘤研究的热点区域。rap2b属于ras癌基因超家族，并与之高度同源，既往研究显示多种肿瘤都存在ras的突变和过度表达。据此推测rap2b基因可能在肺癌的发生发展中可能起重要作用。本研究从mRNA及蛋白水平检测rap2b在肺癌及其对应癌旁组织中表达水平的差异，以探讨rap2b与肺癌发生发展的关系，为肺癌的早期诊断和治疗寻找新的、特异性强的生物学标志及靶点提供实验基础。材料与方法1．标本收集：肺癌及其癌旁组织均取自郑州大学第一附属医院（均签订知情同意书）。年龄年龄32—76岁，其中鳞癌例18例，腺癌12例（均经病理学诊断证实）。收集的新鲜标本立即放入液氮中，后转入-80℃冰箱保存。2．提取组织总RNA：取50—100mg肺癌组织加入1mlTrizol于冰浴中手动匀浆，而后低温离心提取上清液，加入氯仿振荡，低温离心使之分层，提取最上透明层，加入异丙醇振荡后离心可见白色沉淀，加入75％乙醇洗去小分子杂质，而后在空气中干燥，最后用50μlDEPC水溶解。3．RT—PCR（反转录聚合酶链反应）：测提取RNA的吸光度，计算其浓度，取同等量RNA依照逆转录试剂盒说明进行逆转录。以β-actin基因为参照，运用半定量RT-PCR（semi-quantitative RT-PCR）技术检测肺癌及其对应癌旁组织的RAP2B mRNA的表达水平。4．提取组织总蛋白：快速剪取适量标本，0°CPBS充分洗涤，在用冰预冷的悬浮缓冲液中匀浆后，-4℃12000rpm离心样品10min，超声断裂DNA，提取上清液，测取吸光度并计算蛋白浓度，后尽快加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，将样品置于沸水浴中加热10min。5．SDS-PAGE分离蛋白：应用12％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离组织蛋白。6．Western blot：将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，转移上蛋白的硝酸纤维素膜经封闭液封闭后，分别顺序与一抗、二抗杂交，用DAB进行显色观察杂交效果并确定目的蛋白的位置，最后在暗室中用ECL（化学发光法）法曝光显色。7．照相：应用Bioimaging System成像分析系统扫描，并用Gene Tool软件分析各蛋白条带，将结果保存。8．统计学处理：所获资料采用统计分析软件SAS9.13软件处理，rap2b mRNA和蛋白的相对表达量以中位数Median(P₂₅-P₇₅)表示，两组间比较采用秩和检验，率的比较采用卡方检验，检验水准为α=0.05。结果1．RT-PCR半定量结果表明RAP2B mRNA在癌组织的相对表达量为0.155（0.000-0.530），在癌旁组织的相对表达量为0.000（0.000-0.160），两者间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。2．Western blot半定量结果表明RAP2B蛋白在癌组织的相对表达量为0.195（0.050-0.580），在癌旁组织的相对表达量为0.030（0.000-0.180），两者间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。3．rap2b mRNA在肺癌组织的检出率为73.3％（22／30），在对应癌旁组织的检出率为30.0％（9／30），两者间的差异具有统计学意义（P＜0.05）；RAP2B蛋白在肺癌组织的检出率为80.0％（24／30），在对应癌旁组织的检出率为60.0％（18／30），两者间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。4．肺腺癌和肺鳞癌中rap2b mRNA和蛋白的表达水平差异没有统计学意义。结论1．rap2b mRNA在癌组织的相对表达量高于癌旁组织；2．RAP2B蛋白在癌组织的相对表达量高于癌旁组织；3．rap2b mRNA在肺癌组织中的检出率高于癌旁组织；4．rap2b的过度表达可能在肺癌发生发展过程中产生重要作用。