【摘 要】
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以harpinEa蛋白编码基因hrpN的开放阅读框（ORF）为模板,根据毕赤酵母表达载体pPIC6αA的特点设计hrpN片段引物,从含有hrpN基因的pET-hrpN质粒上PCR扩增出hrpN基因。克隆到pUCm-T
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以harpinEa蛋白编码基因hrpN的开放阅读框（ORF）为模板,根据毕赤酵母表达载体pPIC6αA的特点设计hrpN片段引物,从含有hrpN基因的pET-hrpN质粒上PCR扩增出hrpN基因。克隆到pUCm-T载体中,并测序。用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ酶切重组载体pUCm-T-hrpN,得到hrp基因片段,将此片段克隆到毕赤酵母表达载体pPIC6αA上,并置于醇氧化酶（AOX1）启动子和分泌信号因子下游,构建重组表达载体pPIC6αA-hrpN。再用SacⅠ酶线性化,将线性化重组表达质粒pPIC6αA-hrpN经电击转化到毕赤酵母菌株X-33中,用抗生素Blasticidin进行抗性筛选,再经PCR鉴定,获得稳定分泌表达harpinEa蛋白的重组毕赤酵母菌株。甲醇诱导表达,浓缩表达上清,镍柱纯化,SDS-PAGE电泳分析。结果显示,诱导表达96h的毕赤酵母X-33（pPIC6αA-hrpN）明显分泌与harpinEa蛋白大小一致的蛋白。该蛋白的生物活性测定结果表明,表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能。
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