蛋白是生物体一切生命活动的执行者,多数情况下,蛋白质不能独立地在机体中发挥功能,而是在体内与其他多种蛋白质发生相互作用形成大的蛋白复合体来行使其独特功能。蛋白相互作用存在于机体各种生命活动进程中,只有使蛋白相互作用顺利进行,才能保障细胞的正常生命活动。如今,研究蛋白质之间的相互作用关系,建立相互作用关系的网络图,已成为蛋白质组学研究中的热点。研究蛋白质相互作用,对于深入了解蛋白质的功能,阐明生命活动的规律,寻找疾病药物治疗的靶点有着重要的意义。本实验室前期利用差异凝胶电泳(differential in-gel electrophoresis, DIGE)和质谱分析技术鉴定出亚砷酸钠(NaAsO2, As)刺激45min的小鼠胚胎成纤维细胞PRAK+/+与PRAK-/-中发生变化的磷酸化蛋白,得到32个具有统计学意义的差异蛋白点,其中1个是过氧化物酶蛋白1(Peroxiredoxin1, PRDX1)。结果显示,在PRAK+/+细胞中PRDX1的磷酸化水平明显升高,而在PRAK-/-细胞中PRDX1的磷酸化水平变化不大通过对PRAK和PRDX1进行分析我们发现,两者存在一些共性,例如两者在细胞核中均有定位,都参与调控细胞信号转导进程,且在炎症刺激下的应激反应中都发挥了重要作用。据此,我们推测在亚砷酸钠刺激下,细胞内p38MAPK信号通路激活,并进一步激活PRAK蛋白,PRAK蛋白同PRDX1发生某种方式相互作用,使PRDX1蛋白磷酸化水平发生变化,改变其清除氧自由基或分子伴侣功能,从而对机体抗氧化生理功能产生影响。在上述基础上,我们确立了此项研究,即运用相关实验方法来验证PRDX1与PRAK之间的相互作用联系,证明两者是以直接的相互作用或者以间接的相互作用形式参与炎症信号转导,并进一步参与调控机体氧化应激过程。研究结果将为深入了解PRAK及PRDX1的功能提供实验基础。为验证PRDX1和PRAK两者是否具有相互联系,我们首先利用体外Pull Down技术、体内Co-IP技术对两者在体外及细胞内是否具有相互作用进行验证,随后我们选择免疫荧光技术,观察两个蛋白在细胞内的共定位与表达情况。通过以上研究,我们得到以下结论：1.体外结合实验表明,无论使用GST Beads还是His Beads, PRDX1和PRAK原核表达蛋白在体外都未发生特异性结合。2.免疫共沉淀实验时,由于不能将PRDX1和PRAK蛋白与所使用小鼠抗体的轻重链分开,因而没有获得阳性结果,提示我们应选择其他不使用抗体方法进行验证。3.免疫荧光实验表明,单独转染PRDX1质粒时,PRDX1蛋白分布在细胞核及细胞浆中；单独转染PRAK质粒时,外源性PRAK蛋白主要分布在细胞核中。4.免疫荧光实验表明,共转染pcDNA3-PRDX1-myc和pcDNA3-HA-PRAK质粒后,PRDX1和PRAK在细胞核和胞浆中有共定位。5.免疫荧光实验表明,共转染pcDNA3-PRDX1-myc和pcDNA3-HA-PRAK质粒后,过表达的PRDX1蛋白能够使PRAK蛋白移位出核,这提示PRAK蛋白被PRDX1被激活。6.综上表明,PRDX1蛋白和PRAK蛋白可能具有间接相互作用可能性。提示我们下一步工作重点应寻找两蛋白相互联系辅助蛋白,并阐明其参与炎症反应作用机制。综上所述,本课题对PRDX1和PRAK之间的相互作用进行了初步研究,加深了对PRDX1和PRAK在氧化应激过程中发挥作用的认识,研究结果为进一步探索PRDX1和PRAK介导的功能打下了基础。该研究阐述了p38MAPK信号通路通过PRDX1蛋白在氧化应激过程中的作用,为该过程相关疾病的治疗提供了新的思路和方向。