目的:为研究中药复方的配伍规律和组方原理,采用高效液相色谱指纹图谱的方法和血清药物化学的方法对葛根芩连汤进行研究,研究其配伍体外化学成分谱及体内入血成分谱变化,为阐明配伍体外成分谱变化及体内成分谱药动学研究打下基础,并以此来阐明中药配伍后增效减毒的原理。方法:建立葛根芩连汤全方及配伍后产生沉淀的葛根异黄酮、黄芩黄酮、黄连生物碱的液相色谱指纹图谱分析方法,并建立血清中此三类成分的分离方法,考察此三类成分的入血情况,进而研究中药配伍后对成分体内过程的影响。参考相关的文献条件,分别筛选出适合葛根异黄酮、黄芩黄酮、黄连生物碱分离的液相色谱条件;考察处理血清样品的方法,筛选出最适合本方成分的条件。样品的制备:按处方配比取葛根芩连汤各味药（葛根15g,黄芩9g,黄连9g,甘草6g）六份,分别加水400ml,浸泡15min,先煎葛根20min,余药共煎30min,煎二次,趁热120目滤布滤过,合并滤液。90℃定容至1000mL,静置室温后,于箱（4℃）内静置24小时,取出,离心3000r/min,得到约800ml上清液,沉淀加800ml二甲基亚砜使溶解,过滤,取药材单煎,煎煮方法同全方,定容至1000ml,供分析测试用。另平行同前法煎煮浓缩后均定容至200ml,水浴保持30℃,配伍后沉淀研细粉后,加0.5%的羧甲基纤维素钠200ml溶液使其混悬,作为灌胃的样品溶液。取SD大鼠,在给药后1小时,取血5ml,置肝素钠抗凝剂离心管中备用。将采集的血样离心（3000r/min）30min,取上清液,在测定葛根异黄酮、黄芩黄酮入血成分时,选择加入20%三氟乙酸（1∶8）在涡旋混合器上震荡5min,离心（3000r/min）30min,在测定黄连生物碱类成分时,选择甲醇处理同法处理,得到离心上清液,挥干溶剂,再用1.0ml甲醇定容,0.22μm滤膜过滤,得样品溶液。将前述所得的样品溶液分别用高效液相色谱法按照以下条件进行分析:（1）葛根异黄酮类色谱条件:色谱柱:Agilent Zorbax SB C₁₈柱（4.6mm×250mm,5μm）;三元梯度流动相,A为HPLC级超纯水,B为甲醇,C为0.5%的醋酸水溶液,洗脱梯度:0—10min（20%B,20%C）,10—30min（20-30%B,20%-17.5%C）,30—50min（30-80%B,17.5-5%C）,50—51min（80%B,5-0%C）,51—60min（80-100%B）,60—70min（100%B,）;流速:0.6ml/min;柱温:30℃;检测波长:250nm;进样量:10μl。样品分析总时间70min。（2）黄芩黄酮类色谱条件:经筛选后同葛根异黄酮类色谱条件。检测波长280nm。（3）黄连生物碱类色谱条件:色谱柱:Kromasil C₁₈柱（4.6mm×250mm,5μm）;二元梯度流动相,C为磷酸缓冲盐（0.02molKH₂PO4+1.4mlH₃PO₄/L）水溶液,加三乙胺调PH值到6.0,D为乙腈,洗脱梯度:0-10min（90%C,10%D）,10-25min（90-75%C,10%-25%D）,25-35min（75-65%C,25-35%D）,35-45min（65-50%C,35-50%D）,45-50min（50-10%C,90-100）%D;流速:0.8 ml/min;柱温:25℃;检测波长:268nm;进样量:10μl。样品分析总时间50min。分别对分析后所得各峰进行归属来源分析。结果:配伍前后葛根异黄酮类成分变化及归属来源认定:葛根药材单煎与全方上清液比较:得到的指纹图谱峰数目相当,但是从峰面积来看,葛根药材单煎的略高于全方配伍后的。通过与各对照品色谱保留时间及紫外光谱比较分析,大豆苷元在全方配伍后的上清液中不明显,全方中的包括大豆苷在内的3个葛根异黄酮类成分较全方的面积略低。全方上清液与全方配伍后沉淀比较:全方配伍后沉淀中指纹峰数目少于全方上清液,仅有3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素7-芹菜糖苷、大豆苷等五个葛根异黄酮类成分,在图谱中有三个成分类似于葛根异黄酮的紫外吸收行为,但紫外响应值比较低,吸收行为不明显。配伍前后黄芩黄酮类成分变化及归属来源认定:黄芩药材单煎与全方上清液比较,得到的指纹图谱峰数目相当,但是从峰面积来看,黄芩药材单煎的略高于全方配伍后的。通过与各对照品色谱保留时间及紫外光谱比较分析,全方配伍后,黄芩素、汉黄芩素的面积较单煎相差甚远,有很大程度降低。全方上清液与全方配伍后沉淀比较,全方配伍后沉淀中指纹峰数目少于全方上清液,仅有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等四个黄芩黄酮类成分,在色谱图中其它位置,有两个色谱峰紫外吸收行为与黄芩黄酮相近,但由于响应值较低,吸收行为不明显。配伍前后黄连生物碱类成分变化及归属来源认定黄连药材单煎与全方上清液比较,得到的指纹图谱峰数目相当,但是从峰面积来看,通过与各对照品色谱保留时间及紫外光谱比较分析,盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱在全方配伍后在上清液中的峰面积几乎较单煎药材中减少一半,黄连药材单煎高于全方配伍后的,其中盐酸药根碱等三个黄连生物碱类面积变化犹为明显。全方上清液与全方配伍后沉淀比较,全方配伍后沉淀中指纹峰数目相同,面积基本相近,但是各个生物碱之问的比例略有不同,以盐酸小檗碱为参照,以配伍前后峰面积与之相比较,盐酸药根碱配伍前约为配伍后的1.3-1.5倍,盐酸巴马汀配伍前后与盐酸小檗碱比例变化不大。推断盐酸药根碱与葛根异黄酮、黄芩黄酮类成分生成沉淀的能力强于盐酸巴马汀。更容易与葛根异黄酮、黄芩黄酮类成分发生发应生成沉淀。血清药物化学分析部分,根据色谱峰保留时间和紫外吸收行为推断,药材单煎与全方配伍后溶液共有峰相对比,在葛根异黄酮类成分分析中,推测有两个成分为葛根中所含成分直接入血产生,有两个成分可能为入血后的代谢成分;在黄芩黄酮类成分分析中,推测一个成分可能为黄芩中所含成分直接入血产生,但由于其它峰由于紫外响应值太低,不能确定,有待于进一步探讨;在黄连生物碱类成分分析中,推测四个成分为黄连中所含成分入血后代谢产生,其它由于响应值较低,不能确定。结论:沉淀产生的原因可能是由于黄连中的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、黄连碱均为季铵碱,其结构中的氮原子以离子状态存在,同时含有以负离子形式存在的羟基,而葛根中的葛根素具有7位酚羟基,大豆苷元具有4’位酚羟基,可能与氮离子络合形成络合物。由于黄连中含有原小檗碱型生物碱为碱性化合物与黄芩中含有多酚类化合物黄芩甙等酸性化合物相互结合,使黄连黄芩配伍后产生沉淀。配伍后沉淀中黄连生物碱成分种类多,含量与上清液相当,是否是通过配伍后沉淀起到减弱黄连的“苦寒”作用,具体的机制有待于进一步探讨。本实验结果表明,配伍后葛根也与方剂中其他药物发生沉淀反应,产生的沉淀中存在异黄酮类成分,但含量较低,可能是因为全方制剂中含有黄芩黄酮类、甘草酸类成分,三者均为酸性成分,可能存在竞争机制,其具体机制有待于进一步探讨。药材单煎与全方配伍后溶液比较,各药材的入血成分均比全方的入血成分多,推断配伍后因生成沉淀而使所含成分含量降低,但是是否因配伍后生成沉淀而起到减缓黄连、黄芩苦寒的作用有待于药理学、药效学实验的进一步证明。药材单煎与配伍后沉淀相比较,配伍后沉淀获得色谱峰信息较少,且紫外吸收不明显,随给药时间变化不明显,推断可能沉淀入血成分少,吸收速度缓慢。